Steg involverade i polymerasekedjereaktion i DNA-sekvens

Några av de viktigaste stegen som är involverade i polymeraskedjereaktion i DNA-sekvensen är: 1. Steg 1: Denaturering genom värme 2. Steg 2: Annealing Primer till målsekvens 3. Steg 3: Förlängning 4. Steg 4: Slut på den första PGR-cykeln .

Polymeraskedjereaktionen (PGR) förstärker en enda bit DNA över flera storleksordningar, se figur 6.2. Det är skapandet av tusentals miljoner exemplar av en viss DNA-sekvens.

1. Steg 1: Denaturering genom värme:

Värme är normalt mer än 90 grader Celsius vid separering av dubbelsträngat DNA i två enkla strängar. Denna process är känd som "denaturering". Vätgasbindningarna som förbinder baserna med varandra är svaga, därför är denaturering möjlig. Vätebindningarna bryts vid höga temperaturer, medan bindningarna mellan deoxiribos och fosfater förblir intakta, eftersom dessa är starkare förblir intakta.

2. Steg 2: Annealing Primer till målsekvens:

Det ultimata målet med PGR är att replikera en målsekvens av ungefär 100-600 baspar som är unika för organismen som studeras. Riktningen av sekvensen uppnås genom att använda primers. Primers markerar ändarna av målsekvensen.

AMPLICOR® Testprimrar är korta, syntetiska sekvenser av enkelsträngat DNA, som typiskt består av 20-30 baser, med en biotinmärkt 5'-ände för att underlätta detektion. För organismens målområde är de specifika. PGR har två primrar, en för varje komplementär enkel DNA-sträng som producerades under denaturering av enkla DNA-strängar som producerades under denaturering.

Början av DNA-målsekvensen av intresse är markerad av de primrar som anneal (bindar) till den komplementära sekvensen. Annealing sker vanligtvis mellan 40 grader Celsius och 65 grader Celsius, beroende på primers längd och bassekvens.

3. Steg 3: Förlängning:

Temperaturen höjs till ungefär 72 grader Celsius efter att primerna har blivit annaal mot de komplementära DNA-sekvenserna. Dessutom används enzymet Taq-DNA-polymeras för att replikera DNA-strängarna. Taq-DNA-polymeras är ett rekombinant termostabil DNA-polymeras från organismens Thermus-vattenlevande medel och till skillnad från normala polymerasenzymer är aktiv vid höga temperaturer.

Syntesprocessen syntetiserar nya dubbelsträngade DNA-molekyler, båda identiska med den ursprungliga dubbelsträngade mål-DNA-regionen, genom att underlätta bindningen och föreningen av de komplementära nukleotiderna som är fria i lösning (dNTP). Förlängning börjar alltid vid 3'-änden av primern, vilket gör en dubbelsträng ut ur var och en av de två enkla strängarna. Taq-DNA-polymeras syntetiserar uteslutande i 5'-3'-riktningen.

4. Steg 4: Slut på den första PGR-cykeln:

Det finns nu två nya DNA-strängar som är identiska med det ursprungliga målet vid slutet av den första PGR-cykeln. De nybildade strängarna har en början, som exakt definieras av primerns 5'-ände, men 3'-änden är inte exakt definierad.

DNA-strängen syntetiserad från en sådan mall har sedan en exakt definierad längd som är begränsad vid vardera änden av 5'-änden av var och en av de två primrarna. Dessa DNA-strängar är kända som AMPLIGON. DNA-strängar som motsvarar målsekvensen. Efter bara några cykler finns närvarande i mycket större antal än sekvenserna med variabel längd. Sekvensen flankerad eller definierad av de två primrarna är sektionen som förstärks.