Transgena djur: Målet med genöverföring med olika transfektionsmetoder

Transgena djur: Målet med genöverföring med olika transfektionsmetoder!

Ett transgen djur innehåller i sitt genom, en gen eller gener introducerad genom en eller annan transfektionsteknik.

Genen som införs genom transfektion kallas en transgen. I djur specificerar transfektion introduktionen av ett DNA-segment, antingen blött eller integrerat i en vektor, i en djurcell.

Genöverföringsmål:

1. Genetisk modifiering av djur kan syfta till att förbättra sin mjölk, kött, ull, etc. produktion.

2. Gener har överförts till djur för att erhålla en storskalig produktion av proteinerna som kodas av dessa gener i mjölken, urinen eller blodet hos sådana djur.

3. Ett speciellt fall av genöverföring syftar till att lindra eller till och med eliminera symtomen och följdskador av genetiska sjukdomar. I detta tillvägagångssätt introduceras normala och funktionella kopior av den defekta genen i patienten (genterapi).

4. Specifika transgena djurstammar eller linjer skapas för att uppfylla specialiserade experimentella och / eller biomedicinska behov.

Transfektionsmetoder:

Flera metoder har använts för införande av DNA i djurceller / embryon som är följande:

(i) Utfällning av kalciumfosfat.

(ii) Direkt mikroinjektion.

(iii) Retrovirusinfektion.

(iv) lipofektion.

(v) Partikelpistolleverans och

(vi) Elektropoiering.

Utfällning av kalciumfosfat:

I detta tillvägagångssätt löses DNA-beredningen som skall användas för transfektion först i en fosfatbuffert. Kalciumkloridlösningen tillsättes sedan till DNA-lösningen; Detta leder till bildandet av olösligt kalciumfosfat som samfäller med DNA. Kalciumfosfat-DNA-fällningen sättes till cellerna som skall transfekteras.

Fällningspartiklarna tas in av cellerna genom fagocytos. Initialt transfekterades 1-2% av cellerna med denna metod. Men förfarandet har nu modifierats för att erhålla transfektion av upp till 20% av cellerna. I en liten del av de transfekterade cellerna integreras DNA i cellgenomet som producerar stabil eller permanent transfektion.

Denna allmänna inställning kan tillämpas på praktiskt taget alla däggdjursceller, och ett mycket stort antal celler kan behandlas med liten ansträngning. Men många cellinjer gillar inte kalciumfosfatfällningen som klibbar på sina ytor eller på deras substrat.

lipofektion:

Leveransen av DNA till celler som använder liposomer kallas lipofektion. Liposomer är små vesiklar framställda från en lämplig lipid. I början användes nonjoniska lipider för framställning av liposomer, så att DNA skulle införas i blåsorna efter specifika inkapslingsförfaranden.

Användningen av katjoniska lipider för konstruktion av liposomer är en distinkt fördel eftersom DNA spontant och effektivt komplexerar med dessa liposomer vilket gör inkapslingsförfaranden onödiga. De katjoniska liposomerna har ett enda lipid-dubbelskiktsmembran (unilamellär), och de binder effektivt till cellerna. Förmodligen smälter de med plasmamembranet och därigenom levererar DNA (komplexbundet med dem) i cellerna, vilket medför transfektion.

Lipofektion är den metod som valts för transfektion av däggdjursceller in vitro. Det har också använts för att leverera DNA till levande djur genom direkt injektion eller intravenös injektion. Kationiska liposomer har använts vid intravenös eller intratrakeal injektion i möss för uttryck av markörgener i lungor. Målad leverans har också demonstrerats genom att inkorporera specifika ligandproteiner i liposommembranen.

Retroviral infektion:

Rekombinanta retrovirus producerar virioner, vilka används för att infektera djurceller och mössembryon. Det rekombinanta retrovirus-RNA-genomet kopieras genom omvänt transkriptas för att ge en DNA-kopia (intäktstransskription), vilken integreras i cellens genom. Det omvända transkriptaset kodas av retroviruset och produceras omedelbart efter infektion.

Omvänd transkription kan emellertid endast ske i de cellerna, som går genom S-fasen, dvs är mitotiskt aktiva. DNA-kopian av det rekombinanta retroviruset integreras i det cellulära genomet på slumpmässiga ställen och åtföljs vanligtvis inte med deletioner eller omarrangemang.

Mikroinjektion:

I denna metod injiceras DNA-lösningen direkt in i en cells kärna eller in i hanprunukeln från ett befruktat en-till-två-cell-ägg. Typiskt består en mikroinjektionsenhet av ett stereoskopiskt dissekeringsmikroskop med låg effekt (för att se ägget och hela processen) och två mikromekanipulatorer, en för en glasmikropipett för att hålla ägget genom partiell sugning och den andra för en glasinjektionsnål för att introducera DNA i male pronucleus. Den manliga pronucleus är mycket större än den kvinnliga pronucleus av befruktade däggdjursägg. Däremot injiceras DNA i äggcytoplasma i fiskörv.

Det allmänna förfarandet för mikroinjektion är enligt följande: Donorhona induceras att super-ovulera med lämpliga hormonbehandlingar. De superovulerade kvinnorna paras sedan med friska män, och ett stort antal befruktad en eller tvåcellsägg / embryon samlas kirurgiskt. Alternativt uppsamlas obefruktad ägg från super-ovulerade honor; ägget befruktas sedan in vitro. Transgenkonstruktionen framställes i en buffertlösning och injiceras i hanprotesen av befruktade ägg med användning av en mikroinjektionsenhet.