Biologiska metoder för läkemedelsutvärdering

När fysiska eller kemiska metoder för utvärdering eller kvantitet av prov är mycket mindre kan inte ge tillfredsställande resultat i droger utvärderas läkemedlen genom biologiska utvärderingsmetoder. Dessa metoder utförs på levande djur, isolerar levande organ och vävnad, djurberedning och mikroorganismer. De biologiska metoderna för utvärdering utförs på levande organismer kallas bioassay eller biologisk analys.

Följande metod används som:

1. Anti-inflammatorisk aktivitet av droger

2. Antipyretisk aktivitet av droger

3. Anti-diabetisk aktivitet av droger

4. Analgetisk aktivitet av droger

5. Antiulceraktivitet av droger

6. Antelmintisk aktivitet av läkemedel: De utförs på jordmaskar

7. Hjärtaktivitet av läkemedel: hjärtglykosiderna utvärderas på groda och duvor

8. Mikrobiologiska metoder: levande bakterier, jäst och mögel används för att analysera vitaminer och bestämma aktiviteten hos antibiotika.

Antiinflammatorisk aktivitet av läkemedel:

Paw-ödemmetod:

Manliga eller kvinnliga Sprague-Dawley-råttor med en kroppsvikt mellan 100 och 150 g används. Djurna svälter över natten. För att säkerställa enhetlig hydratisering, får råttorna 5 ml vatten genom magslangen (kontroller) eller testmedicinen upplöst eller suspenderad i samma volym. Trettio minuter senare utmanas råttorna genom en subkutan injektion av 0, 05 ml 1% lösning av karragen och in i plantarsidan av vänster bakpote. Poten är märkt med bläck vid nivån på lateral malleolus och nedsänkt i kvicksilver upp till detta märke.

Tassvolymen mäts pletysmografiskt omedelbart efter injektion, igen 3 och 6 h, och så småningom 24 h efter utmaning. Ökningen av tassvolymen efter 3 eller 6 h beräknas som procent jämfört med volymen uppmätt omedelbart efter injektion av irriterande för varje djur.

Effektivt behandlade djur visar mycket mindre ödem. Skillnaden mellan medelvärdena mellan behandlade djur och kontrollgrupper beräknas för varje tidsintervall och utvärderas statistiskt. Skillnaderna vid de olika tidsintervallerna ger några tips om hur länge den antiinflammatoriska effekten är. En dosresponsskurva körs för aktiva läkemedel och ED _50- värden kan bestämmas.

Bomullullgranulommetod:

Manwisterrotter med en medelvikt av 200 g bedövas med eter. Ryggskinnet rakas och desinficeras med 70% etanol. Ett snitt görs i ländryggsregionen. Genom en trubbig tång bildas subkutana tunnlar och en steriliserad bomullspellett placeras på båda sidor i skapulärområdet.

Pelletsna är antingen standardiserade för användning i tandvård som väger 20 mg eller pellets bildade av rå bomull, vilket ger en mer uttalad inflammation än blekt bomull. Djuren behandlas i 7 dagar subkutant eller oralt.

Därefter offras djuren, pelletsna framställes och torkas tills vikten förblir konstant. Netto torrvikt, dvs efter avdragning av bomullspellets vikt bestäms. Medelvikten för pelletsen i kontrollgruppen såväl som för testgruppen beräknas. Den procentuella förändringen av granulomvikt i förhållande till vehikelkontrollgruppen bestäms.

Antipyretisk aktivitet av läkemedel:

Kaniner av båda könen och av olika stammar med en kroppsvikt mellan 3 och 5 kg kan användas. Djuren placeras i lämpliga burar och termoelement kopplade till en automatisk inspelare införs i ändtarmen. Djuren får anpassa sig till burarna under 60 minuter.

Därefter injiceras 0, 2 ml / kg innehållande 0, 2 μg lipopolysackarid intravenöst i kaninöret. Sixtio minuter senare administreras testföreningen antingen subkutant eller oralt. Kroppstemperaturen övervakas i minst 3 timmar.

En minskning av kroppstemperaturen för minst 0, 5 ° C i mer än 30 min jämfört med temperaturvärdet före administrering av testföreningen betraktas som positiv effekt. Detta resultat har hittats efter 45 mg / kg fenylbutazon subkutan eller 2, 5 mg / kg indometacin subkutan.

Antidiabetisk aktivitet av droger:

Streptozotocininducerad diabetes:

Male Wister råttor som väger 150-220 g matas med en standarddjurs injiceras intravenöst med 60 mg / kg streptozotocin (Calbiochem). Precis som hos alloxan observeras tre faser av blodglukosförändringar. Initialt ökas blodglukosen och når värden på 150-200 mg% efter 3 timmar. Sex till åtta timmar efter streptozotocin ökas seruminsulinvärdena upp till 4 gånger, vilket resulterar i en hypoglykemisk fas som följs av långvarig hyperglykemi. Allvarlighetsgrad och uppkomsten av diabetiska symptom beror på dosen streptozotocin.

Efter dosen 60 mg / kg intravenös. Symtom uppstår redan efter 24-48 timmar med hyperglykemi upp till 800 mg%, glukosuri och ketonemi. Histologiskt degreras beta-cellerna eller till och med nekrotiska. Ett stabilt tillstånd uppnås efter 10-14 dagar, vilket möjliggör användning av djuren för farmakologiska test.

Alloxaninducerad diabetes: Kaniner som väger 2, 0 till 3, 5 kg infunderas via öronvenen med 150 mg / kg alloxanmonohydrat (5, 0 g / 100 ml, pH 4, 5) i 10 minuter vilket resulterar i att 70% av djuren blir hyperglykemiska och urikosuriska. Resten av djuren dör antingen eller är bara tillfälligt hyperglykemisk.

Analgetisk aktivitet av läkemedel:

Hot Plate Metod:

Grupper av 10 möss av antingen kön med en initialvikt på 18 till 22 g används för varje dos. Värmeplattan, som är kommersiellt tillgänglig, består av en elektriskt uppvärmd yta. Temperaturen regleras för 55 ° till 56 ° C. Detta kan vara en kopparplatta eller en uppvärmd glasyta. Djuren placeras på värmeplattan och tiden tills antingen slickning eller hoppa sker registreras av en stoppur. Latensen registreras före och efter 20, 60 och 90 minuter efter oral eller subkutan administrering av standarden eller testföreningen.

Tail immersion test:

Unga kvinnliga Wister-råttor (170-210 g kroppsvikt) används. De placeras i enskilda fasthållande burar som lämnar svansen och hänger ut fritt. Djuren får anpassa sig till burarna i 30 minuter innan de testas. Den nedre 5 cm delen av svansen är märkt. Denna del av svansen är nedsänkt i en kopp nyfyllt vatten på exakt 55 ° C. Inom några sekunder reagerar råttan genom att dra tillbaka svansen. Reaktionstiden registreras i 0, 5 s enheter med en stoppur. Efter varje bestämning torkas svansen försiktigt.

Reaktionstiden bestäms före och periodiskt efter antingen oral eller subkutan administrering av testämnet, t.ex. efter 0, 5, 1, 2, 3, 4 och 6 timmar. Avstängningstiden för nedsänkning är 15 s. Uttagningstiden för obehandlade djur är mellan 1 och 5, 5 s. En återtagstid på mer än 6 s betraktas därför som ett positivt svar.

Heffners halsklips metod:

Ett artärklämma appliceras på roten på musens svans och reaktionstiden noteras. Manliga möss (Charles River-stam eller andra stammar) med en vikt mellan 18 och 25 g används. Kontrollgruppen består av 10 möss. Testföreningarna administreras subkutant till matade möss eller oralt till fastade djur. Testgrupperna och kontrollgruppen består av 7-10 möss.

Läkemedlet administreras 15, 30 eller 60 min tidigare testning. Ett artärklämma appliceras på roten på svansen (ungefär 1 cm från kroppen) för att framkalla smärta. Djuren svarar snabbt på denna skadliga stimulans genom att bita klippet eller svansen nära klippets plats. Tiden mellan stimulanspåverkan och respons mäts av en stoppur i steg om 1/10 sekunder.

Antiulceraktivitet :

Pylorusligation hos råttor (Shay Rat):

Kvinna Wister-råttor som väger 150-170 g sväljs i 48 timmar med tillgång till dricksvatten ad libitum. Under den här tiden är de inrymda i burar med upphöjda bottnar av bredt trådnät för att undvika kannibalism och coprophagy. Tio djur används per dos och som kontroller. Under eterbedövning görs en mittlinje i buken. Pylorus är legat, omsorg utövas som inte skadar blodet.

Ingen försörjning eller dragkraft på pyloran uppstår. Att ta tag i magen med instrument är att noggrant undvikas; annars kommer ulceration att utvecklas på sådana punkter. Buksväggen är stängd av suturer. Testföreningarna ges antingen oralt genom foder eller injiceras subkutant.

Djuren placeras i 19 h i plastcylindrar med en inre diameter av 45 mm som är stängda i båda ändar genom trådnät. Därefter offras djuren i CO ₂ -bedövning. Magen öppnas och en ligatur placeras runt matstrupen nära membranet.

Magen avlägsnas och innehållet dräneras i ett centrifugrör. Längs den större krökningen öppnas magen och pinnas på en korkplatta. Slemhinnan undersöks med stereomikroskop. I råttan bildar de övre två femtedelarna av magen buken med skvättepitel och har små skyddsmekanismer mot korrosiv verkan av magsaften.

Under en begränsande ås i magen i magkörteln är de skyddande mekanismerna bättre i slemhinnan i mediet två femtedelar av magen än i den lägsta delen, vilket bildar antrummet.

Därför förekommer lesioner huvudsakligen i buken och i antrummet. Antalet sår noteras och svårighetsgraden registreras med följande poäng:

. 0 = inget sår

. 1 = ytliga sår

. 2 = djupa sår

. 3 = perforering.

Mängden magsinnehåll mäts. Efter centrifugering bestäms surheten genom titrering med 0, 1 n NaOH.

Utvärdering:

Ett ulcerindex UI beräknas:

UI = UN + US + UP x 10-1

jag. UN = medelantal sår per djur

ii. US = genomsnitt av svårighetsgrad

III. UP = andel av djur med sår

Ulcerindex och surhet av magsinnehållet hos behandlade djur jämförs med kontroller. Med hjälp av olika doser kan dosresponskurvor etableras för sårbildning och magsyrautsöndring. ID50-värden kan beräknas med sannolikhetsanalys, varvid 0% motsvarar nej och 100% till maximal stimulerad magsyrautgång.

Stressår genom immobiliseringsstress:

Grupper av 10 kvinnliga Wister-råttor per dos av testläkemedlet och för kontroller som väger 150-170 g används. Mat och vatten dras 24 timmar före experimentet. Efter oral eller subkutan administrering av testföreningen eller placebolösningen bedöms djuren lite med eter.

Både nedre och övre extremiteterna är fasta ihop och djuren är inslagna i trådblicken. De suspenderas horisontellt i mörkret vid 20 ° C under 24 timmar och slutligen offras i CO ₂ -bedövning. Magen avlägsnas, fixeras på en korkplatta och sårets antal och svärighetsgrad registreras med ett stereomikroskop med följande värden:

.0 = inget sår

.1 = ytliga sår

.2 = djupa sår.

.3 = perforering

Utvärdering

Ett ulcerindex UI beräknas:

UI = UN + US + UP x 10-1

FN - genomsnittligt antal sår per djur.

US = genomsnitt av svårighetsgrad.

UPP - Procent av djur med sår