Sporefärgning av bakterier för att differentiera bakteriell spore och vegetativ cell

Ändamål:

Alla bakterier förblir i sina "vegetativa former", om miljöförhållandena är gynnsamma för deras normala metaboliska aktiviteter.

I denna form tar de upp näringsämnen, växer och reproduceras.

Å andra sidan dör de flesta av dem när miljöförhållandena blir negativa, såsom svår kyla, extrem värme, åldrande, brist på näringsämnen, exponering för strålning och giftiga kemikalier.

Men få arter av bakterier kan överleva under sådana ogynnsamma förhållanden genom att ändra sig till mycket resistenta, metaboliskt inaktiva former som kallas "sporer". Vid negativa förhållanden produceras en spore inom en vegetativ cell genom dehydrering och sammandragning av dess cellinnehåll.

Denna spore, bildad inuti bakteriecellen, kallas "endospore" (Figur 2.13). Om negativa förhållanden förvärras, bryter cellen, släpper ut endosporan, som nu blir en oberoende vilande cell som kallas 'spore'.

Sporbildningsprocessen kallas sporogenes. Sporan har tjocka, relativt ogenomträngliga skikt, såsom spore cortex och spore coat, som skyddar cellen från någon fysisk skada. Spore får sitt motstånd genom flera mekanismer, som ännu inte klart har förklarats.

När förhållandena blir gynnsamma ger skikten som täcker spårbrottet och sporet upphov till en metaboliskt aktiv vegetativ cell. Denna process kallas "grobarhet".

På basis av förmågan att bilda sporer kan således bakterier delas in i två grupper enligt följande:

(1) Sporbildande bakterier (Sporeformare):

En bakterie som kan producera en spore för att överleva under ogynnsamma miljöförhållanden är en sporbildande bakterie (spore-former). För det mesta kan följande tre genera av stavformade bakterier producera sporer under ogynnsamma miljöförhållanden.

A. Aerobe stavformade bakterier

1. Bacillus spp.

B. Anaeroba rodformade bakterier

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Sporbildande bakterier (icke-sporeformare):

En bakterie, som inte kan producera en spore och därför dör i sin vegetativa form under ogynnsamma miljöförhållanden, är en icke-sporbildande bakterie (icke-sporeformig).

Syftet med sporefärgning är att differentiera sporer och vegetativa celler i en sporeformer och att skilja sporformare från icke-spårformare. Sporefärgning är också till hjälp vid identifiering av bakterierna som tillhör släktet Bacillus, Clostridium och Desulfotomaculum.

Princip:

Sporerna skiljer sig från de vegetativa cellerna genom att de har tjocka, relativt ogenomträngliga lager runt dem (Figur 2.14). Den primära fläcken, malakitgrön, kan inte tränga in i sporerna genom dessa lager.

Därför förstärks penetreringen av den primära fläcken genom applicering av värme, som driver den genom täckskikten i sporeprotoplasten. Nu ser sporerna grönt ut. När sporerna behandlas med avfärgningsmedlet, kranvatten, genomgår de inte avfärgning, eftersom de utesluter vatten.

Kranvattnet tar bort endast det överskott av primär fläck som finns i spårens omgivning. Sporerna behåller sålunda den gröna färgen. Därefter kan safraninmolekylerna inte gå in i sporerna genom täckskikten när de färgas mot safranin. Således håller sporerna slutligen den primära fläckens gröna färg och verkar grön.

Å andra sidan tar de vegetativa bakteriecellerna upp den primära fläcken, malakitgröna, men fläcken har ingen stark affinitet för vegetativa cellkomponenter, på grund av vilka den tvättas bort, när de avfärgas under kranvatten.

Nu förefaller de vegetativa cellerna färglösa. När de färgas mot safranin tar de färglösa vegetativa cellerna upp fläcken och verkar röda till skillnad från sporerna, som ser gröna ut.

Material som krävs:

Slide, loop, malakitgrön, safranin, sporbildande bakterier, varmplatta, mikroskop, nedsänkningsolja.

Procedur:

1. En rutschkana rengörs ordentligt under kranvatten, så att vatten inte kvarstår som droppar på dess yta.

2. Det vidhäftande vattnet torkas ut med bibulous papper och glidret lufttorkas.

3. Ett smet av sporbildande bakterier görs i mitten av ett objektglas i två metoder som ges nedan.

(en) Om sporeformare odlad på agarplatta eller agarskärning skall observeras placeras en droppe vatten i mitten av glidbanan. En slinga steriliseras över flamma och en Clostridium-slinga av bakterier från en åldrad platta eller snedkultur (48-72 timmar gammal) av sporeformer, såsom Clostridium-supergener eller Bacillus subtilis, överförs till vattendroppen.

Därefter tillverkas en bakteriesuspension genom försiktig rotation av slingan i vattendroppen och droppen sprids tills ett smet erhålls. När åldern av sporbildande bakterier på plattor eller snedkulturer ökar bildar de sporer.

(B) Om sporeformare odlad i flytande buljong skall observeras utsätts buljongkulturen, som innehåller endast vegetativa celler, värmespänning genom upphettning på ett vattenbad i 15 minuter, så att några av de vegetativa cellerna bildar sporer för att övervinna värme stress. En droppe av den blandade spore-vegetativa cellsuspensionen från buljongkulturen placeras direkt i glidens mitt genom en steril slinga och ett smet görs genom spridning.

4. Smeten är lufttorkad.

5. Smetret fixeras genom uppvärmning. Uppvärmning resulterar i koagulering av de cellulära proteinerna, på grund av vilka cellerna håller sig fast vid glidytan och inte tvättas bort under färgning. Värmefixering görs genom att snabbt övergå gliden högt över en flamma 2-3 gånger med smeten ytan vetter uppåt, så att smet inte blir uppvärmt.

6. Smetet översvämmas med den primära fläcken, malakitgrön.

7. Glidret hålls på en varm kokplatta och beredningen får stå i 2-3 minuter. Temperaturen på varmplattan är så justerad att förberedelsen inte kokar och förångas snabbt. Förångningsförlusten fylls på, så att smeten inte blir upptorkad.

8. Sliden tas bort från kokplattan och kyls.

9. Smetet avfärgas genom att tvätta under försiktigt strömmande kranvatten, så att vatten inte faller direkt på smeten.

10. Smetret översvämmas med motfläcken, safranin, i 30 sekunder.

11. Överflödig fläck tvättas helt bort från smeten under försiktigt strömmande kranvatten, på så sätt att vatten inte faller direkt på smeten.

12. Glidret är blottat torrt med bibulous papper.

13. Sliden är klippt till mikroskopets stadium och smetet observeras under låg effekt och höga torrmål.

14. En droppe nedsänkningsolja sätts på smeten.

15. Smetet observeras under olje-nedsänkningsmål.