HLA: Histokompatibilitetstestmetoder

Histokompatibilitetstestmetoder!

HLA-systemet är omfattande polymorf. Den polymorfa naturen av HLA-alleler hittades ursprungligen och definierades genom serologiska metoder och HLA-antigenerna gavs siffror. Senare fann man att antigener med samma serologiska specificitet kan ha olika aminosyrasekvenser. Vid 1999 översteg antalet kända HLA-alleler 1000 och antalet ökar fortfarande. På grund av den omfattande polymorfismen är nomenklaturen för HLA allelerna komplexa och det är också svårt för en person att förstå nomenklaturen, såvida inte personen är i histocompatibility-fältet.

De första sekvenserade allelerna tilldelades namn med två siffror som motsvarade deras serologiska specificitet. De två första siffrorna följs av ytterligare två siffror som anger den kronologiska ordningen för namngivning av WHO: s nomenklaturkommitté för faktorer i HLA-systemet. (Till exempel. Den första allelen sekventerad från en HLA-A2-gen benämndes HLA-A 0201 och den andra allel sekvensen benämnd HLA-A 0202.)

HLA-typing görs genom serologiska typmetoder eller molekylära typmetoder. De serologiska HLA-typmetoderna detekterar epitoperna av HLA-molekylerna, medan de molekylära metoderna detekterar nukleotidsekvenserna.

jag. HLA-typing som definierar grupper av alleler (vanligen approximativa serologiska specificiteter) kallas lågupplösning eller generisk typning (till exempel HLA-DRBl-04).

ii. Att skriva den lösa alla kända alleler kallas HLA-typing med hög upplösning (till exempel HLA-DR BI x401).

III. Att skriva som löser sig bortom serologiska särdrag men som inte uppnår allelivå kallas mellan-upplösningstypning (till exempel HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

National Marrow Donor Programmet har skapat kod för att underlätta hanteringen av dessa komplexa mellanupplösningsdata. I detta system är namnet för HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.

Histokompatibilitetstestning med serologiska metoder:

Lymfocyter används för serologisk HLA-typing, antikroppsscreening och cross-matchning.

Isolering av lymfocyter för HLA-typning:

jag. Perifert venöst blod blandas med Ficoll-Hypaque och centrifugeras. Skiktet innehållande perifera blodmononukleära celler aspireras, tvättas och används.

ii. Lymfocyter isolerade från lymfkörtlarna och mjälten av kadaver används.

III. HLA-typing för klass II-antigener görs med berikade B-cellpopulationer (Cirka 80 procent av normala perifera blod-T-celler vilar T-celler som saknar klass II-antigener på deras yta).

iv. Anti-CD2 eller anti-CD3 mAbs-belagda magnetiska pärlor används för att isolera T-celler; och anti-CD19 mAbs-belagda magnetiska pärlor används för att isolera B-celler.

Detektion av HLA-antigener av lymfocyter:

Mikrocytotoxicitetsanalys är en komplementberoende lymfcytotoxicitetsanalys. Frysta typbrickor innehållande brunnar belagda med olika antikroppar mot HLA-antigener är kommersiellt tillgängliga.

Cirka 2000 lymfocyter avges i varje brunns brunn och inkuberas i 30 minuter vid rumstemperatur. (Antikroppar i varje brunn binder till specifika HLA-antigener på ytan av lymfocyter, om sådana finns).

↓

Fem μl komplement (vanligtvis kaninserum) tillsätts till varje brunn och inkuberas under 60 minuter (komplementproteiner orsakar död av lymfocyter som är belagda med mAbs. I frånvaro av mAb-bindning med lymfocyter aktiveras komplementet inte och lymfocyterna dödas inte).

↓

Färgen eosin Y, följd av formaldehyd (formaldehyd fixerar reaktionen) tillsätts.

↓

Därefter räknas de döda cellerna och levande cellerna i varje brunn under ett faskontrastmikroskop.

jag. Svullna och mörka celler är döda celler (Färgen eosin Y går in i döda celler).

ii. Ljusa och refraktila celler är levande celler (Färgen eosin Y går inte in i levande celler).

Varje brunn i facket ses individuellt för döda celler och levande celler. Andelen dödceller i varje brunn beräknas och poängen görs enligt tabell 27.5.

Tabell 27.5: Scoring av lymfcytotoxicitetstestet för HLA:

Procent av döda lymfocyter i brunnen	Göra	tolkning
0-10	1	Negativ
11-20	2	Tvivelaktigt positiv
21-50	4	Svag positiv
51-80	6	Positiv
81-100	8	Starkt positivt

HLA-typen hos en individ bestäms genom tolkning av reaktionen hos individens lymfocyter med olika antisera som används i det komplementberoende lymfcytotoxicitetstestet.

jag. Varje individ förväntas ha två HLA-A, två HLA-B och två HLA-C-antigener på ytan av lymfocyter.

ii. Om en individ endast visar ett HLA-A- eller HLA-B- eller HLA-C-antigen i testet är förmodligen den individen homozygot för det specifika antigenet eller den antiserapanel som används i testet har inte den specifika antikroppen mot den andra antigen eller det är lågt uttryck av HLA-molekyler på lymfocytytan.

Den komplementberoende lymfcytotoxicitetsanalysen för HLA-DR- och HLA-DQ-antigener görs genom att använda B-celler isolerade av mAB-belagda magnetiska pärlor eller B-celler isolerade över nylonull.

De flesta av HLA-typssera erhålls från multiparösa kvinnor. Eftersom de mutioparösa kvinnorna upprepas utsätts för fosterens HLA-antigener, har sera hos multiparösa kvinnor antikroppar mot HLA-antigener. Nästan 200 olika antisera används för att skriva en individs HLA-antigener.

Det ansågs ursprungligen att mAb till varje HLA-antigen kunde utvecklas och HLA-typningen skulle vara enkel. Men många mAbs binder till de gemensamma epitoperna snarare till de privata epitoperna av HLA-antigenerna. Dessutom fixar många murina mAb inte komplement (och följaktligen är deras användning i komplementberoende lymfcytotoxicitetsanalys begränsad).

Emellertid kan murina mAb användas i ELISA-metoden och flödescytometrimetoden, som inte kräver komplement. Senast föredrar många laboratorier att använda molekylär HLA-typning, snarare än serologisk HLA-typing.

Screening av transplantatmottagarens serum för antikroppar mot l-ILA-antigener (antikroppsscreening):

Förekomsten av antikroppar mot HLA-antigener i serum hos en väntande organtransplantationsmottagare görs vanligen genom komplement-beroende lymfcytotoxicitet. Lymfocyter med kända HLA-antigener och komplement blandas med mottagarens serum. Efter lämplig inkubation räknas de döda lymfocyterna och levande lymfocyter. Den procentuella panelreaktiva antikroppen (PRA) beräknas därefter.

PRA = Antal positiva celler / Antal totala paneler x 100

PRA indikerar omfattningen av sensibilisering hos den väntande mottagaren till HLA-antigener.

ELISA-metod för att skärma serum HLA-antikroppar:

ELISA-metoden är lätt, snabb och kräver inte levande lymfocyter såväl som komplement. Affinitetsrenade HLA-antigener beläggs på mikrotiterplattans väggar

↓

Mottagarens serum tillsättes och inkuberas

↓

Efter tvättning tillsätts enzymkonjugerat anti-humant IgG och inkuberas.

↓

Efter tvättning tillsätts substrat och inkuberas.

jag. Utveckling av färg i en viss brunn indikerar förekomsten av IgG-antikroppar mot HLA-antigenet belagt på den speciella brunnen.

ii. Icke-utveckling av färg i en viss brunn indikerar frånvaron av antikroppar mot det speciella HLA-antigenet som är belagt på den brunnen.

Flödescytometer för att detektera serum HLA-antikroppar:

Mikrokulor belagda med HLA-antigener inkuberas med patientens serum och därefter med fluorescerande märkta anti-humana IgG-antikroppar. Procenten av pärlor som fläckar över bakgrunden ger måttet på patientens procentiga panelreaktiva antikroppar (PRA).

Cross Matchning:

Om blod från en väntande mottagare innehåller antikroppar mot donator-HLA-antigenerna, kommer HLA-antigenerna på donatorcellerna att attackeras av mottagarens antikroppar vid transplantation. Därför före transplantation är det viktigt att veta om mottagaren har antikroppar mot donator-HLA-antigenerna.

Om donor HLA-antigenspecifika antikroppar är närvarande i mottagarens serum, kommer transplantationen att avvisas. Kors-matchning görs för att detektera närvaron av väntande mottagares serumantikroppar mot de föreslagna donator-HLA-antigenerna.

Lymfcytotoxicitet Kors som passar med perifert blodlymfocyter:

Perifera blodlymfocyter hos den föreslagna givaren (som ungefär innehåller 80 procent T-celler (som bär MHC klass I antigener) och 20 procent B-celler och monocyter (som bär MHC klass I och klass II antigener) blandas med den väntande mottagarens serum och inkuberas .

↓

Komplement tillsätts och inkuberas.

↓

Färgen eosin Y tillsätts och inkuberas.

jag. Antalet döda och livskraftiga celler räknas och procentandelen döda celler beräknas. 50 procent eller mer celldöd indikerar en stark positiv korskamp (det vill säga mottagarens serum har antikroppar som kan reagera med donator-HLA-antigener). En stark positiv korsning mellan en mottagare och en föreslagen givare är en kontraindikation för organtransplantation från givaren till mottagaren.

För att undersöka om mottagarens antikroppar är riktade mot antigenen i klass I eller klass II görs T-celllymfcytotoxicitetskors-matchning (med användning av berikad T-celler) eller B-cell-lymfcytotoxicitetskors-matchning (med användning av berikade B-celler).

Flödescytometerskorsning är 30-250 gånger känsligare än de visuella serologiska metoderna för detektion av IgG-antikroppar mot HLA-antigener på ytan av lymfocyter.

Perifera blodlymfocyter hos den föreslagna givaren inkuberas med märkt (till exempel ett fluorescerande färgämne som avger grönt ljus) anti-CD3 mAb, vilka binder till T-celler.

↓

De märkta ani-CD3 bundna T-cellema separeras från B-celler i flödescytometern.

↓

De separerade, färgade T-cellerna inkuberas nu med den väntande mottagarens serum.

jag. Mottagarens serumantikroppar mot donator-T-cell-HLA-antigenerna, om de är närvarande, kommer att binda till T-cellerna.

↓

Efter tvättning tillsätts en flurokrom (som avger en färg, annan än grön, röd färg) märkt anti-humant IgG och inkuberas.

ii. Den florokrommärkta anti-humana IgG binder till mottagarens HLA-antikroppar, som är bundna till donator-T-cellerna.

Flödescytometern räknar antalet T-celler (röd och grön färg) och T-celler (grön färg) och skapar ett histogram.

Korsmatchning för autoantikroppar mot lymfocyter:

Under en korssträckning kan autoantikroppar mot lymfocyter i mottagarens serum binda icke specifikt till donatorlymfocyterna och ge ett falskt positivt korsresultat. och följaktligen diskvalificeras givaren felaktigt från donerande organ till den särskilda mottagaren. Autoantikroppar kan också maskera närvaron av specifika antidonorantikroppar.

Förekomsten av autoantikroppar mot lymfocyter detekteras av den automatiska korsningen, där mottagarens egna lymfocyter och serum kombineras i ett standard cytotoxicitetstest. Autoantikroppsöverensstämmelser görs rutinmässigt i samband med alla levande donorkors-matchningar för varje serum som testas.

Molekylärbiologi Metoder för HLA-typning:

De flesta molekylära typmetoderna använder polymeras kedjereaktionsteknik (PCR) för att selektivt amplifiera HLA-gensegmenten som krävs för typning.

Sekvens-specifik Priming (SSP) Typing:

DNA från individen extraheras från celler eller vävnader

↓

DNA tillsätts till rör innehållande olika primersatser för olika HLA-gener. En ytterligare uppsättning primers ingår som en positiv kontroll av amplifieringen i alla rören.

'↓

Övriga komponenter i PCR-reaktion (såsom DNA-nukleotider, DNA-polymeras, buffert) tillsättes och termisk cykling utförs.

↓

De amplifierade produkterna elektroforeseras i gel med etidiumbromid och fotograferas under UV-ljus.

jag. Närvaron av band indikerar att DNA-provet har sekvensen som motsvarar den speciella HLA-typen.

ii. Frånvaro av band indikerar att DNA-provet inte innehåller den särskilda sekvensen av HLA-typen.

III. Det interna amplifieringsstyrbandet bör vara närvarande för tolkning.

Satser av primers för HLA-typing är kommersiellt tillgängliga.

jag. För HLA-A, B och C-typing krävs cirka 100-200 reaktioner.

ii. För HLA-DRB-typing krävs ca 20-30 reaktioner.