DNA-replikation: Anmärkningar om DNA-replikering, reparation och rekombination

Anmärkningar om DNA-replikering, reparation och rekombination!

DNA-replikation:

Halvkonservativ DNA-replikation:

DNA-replikation är en autokatalytisk funktion av DNA. Det uppträder vanligtvis under S-fasen av cellcykeln när kromosomer är i mycket utsträckt form. Som föreslagits av Watson och Crick är DNA-replikation semi-konservativ.

I den halvkonservativa replikationen skulle de två strängarna skilja sig från varandra, behålla sin integritet och var och en kommer att syntetisera, från poolen av nukleotider, dess komplementära sträng. Resultatet skulle vara att den nyligen syntetiserade molekylen skulle bära eller bevara en av de två strängarna från modermolekylen och den andra strängen skulle vara nyligen sammansatt. Det finns tillräckliga bevis för att bevisa att dubbelsträngat DNA verkligen replikeras genom halv-konservativ metod.

Meselson och Stahls experiment (1958):

Dessa arbetare odlade Escherichia coli i ett medium innehållande ¹⁵ N isotoper. Efter att dessa hade replikerats i några generationer i detta medium innehöll båda strängarna av detta DNA ¹⁵ N som beståndsdelar i puriner och pyrimidiner. När dessa bakterier med ¹⁵ N överfördes till ett odlingsmedium innehållande ¹⁴ N fann man att DNA separerat från fräsch generation av bakterier besitter en sträng tyngre än den andra.

Den tyngre strängen representerar föräldrasträngen och ljusare en är den nya som syntetiseras från odlingsmediet, vilket således indikerar semi-konservativ metod för DNA-replikation och exkluderar både konservativa och dispersiva modeller av DNA-syntes och replikation.

Konservativ replikation skulle inte producera några DNA-molekyler med en "hybrid" konstitution. Om replikation var dispersiv skulle det ha varit ett skift av DNA från "tungt mot" ljus "genom varje generation.

Efterföljande studier har verifierat Meselson och Stahls slutsats att DNA-replikation är halvkonservativ och har utökat den till många andra organismer, inklusive högre växter och djur.

Cairns autoradiografi experiment:

Han använde radioaktiv tymin eller tritierad tymidin. Genom att växa E. coli i ett odlingsmedium innehållande tritierad tymidin inkorporerades radioaktiviteten i dotter-DNA-molekylerna.

I autoradiograf visar den duplicerande DNA-molekylen en replikerande gaffel, den punkt vid vilken två kedjor blir fyra. Efter första replikation ses radioaktiviteten att vara inkorporerad i endast en av DNA-strängarna och båda strängarna befinner sig märkta efter andra replikation. Detta stöder de semi-konservativa lägena för DNA-replikering.

JH Taylors experiment på Viciafaba-rottips (1957) bekräftar också den semi-konservativa metoden för DNA-replikering.

jag. Diskontinuerlig DNA-replikation:

Okazaki föreslog att DNA-syntesen fortskrider samtidigt på båda DNA-strängarna som använder samma enzym-DNA-polymeras i form av små isolerade fragment. Dessa segment är kända som Okazaki-bitar och består av 1000-2000 nukleotider. Dessa förenas samman av enzymet polynukleotidligas, vilket fullbordar bildningen av polynukleotidkedjan.

Den diskontinuerliga syntesen av DNA stöds av auto-radiografiskt experiment.

ii. Enriktad och dubbelriktad replikering av DNA:

J. Cairns från hans experiment drog slutsatsen att DNA-syntesen börjar vid en bestämd punkt på kromosomerna och fortsätter i en riktning, men de senaste experimenten tyder på dubbelriktad replikation.

Levinthal och Cairns föreslog att de två strängarna under replikationen inte separerade helt innan replikationen. I stället börjar de unzippa i ena änden och samtidigt börjar de unzippade segmenten locka sina nukleotidpar. På detta sätt går unzipping av de ursprungliga DNA-strängarna och syntesen av färska DNA-strängar sida vid sida.

DNA-polymeras:

DNA-polymeras är det huvudsakliga enzymet för DNA-replikation. Dess aktivitet demonstrerades först av Kornberg 1956. Den katalyserar det kovalenta tillsatsen av deoxiribonukleotider till 3'-OH av en tidigare existerande nukleotid som kallas som primer.

DNA-polymeras-1-enzym anses nu vara ett DNA-reparationsenzym snarare än ett replikationsenzym. Detta enzym är känt att ha fem aktiva ställen, nämligen mallplats, primerställe, 5'-> 3'-klyvnings- eller exonukleas-plats, nukleosidtrifosfatställe och 3'-> 5'-klyvningsplats (eller 3'-> 5'-exonukleas-ställe ).

DNA-polymeras I:

Det är huvudsakligen inblandat i att ta bort RNA-primrar från Okazaki eller prekursorfragment och fylla de resulterande luckorna på grund av dess 5'-> 3 'polymeriseringskapacitet. DNA-polymeras I-enzym kan också avlägsna tymindimerer framställda på grund av UV-bestrålning och fylla gapet på grund av excision. Detta kallas korrekturläsning eller redigering av detta enzym.

DNA-polymeras-II:

Detta enzym liknar DNA-polymeras-I i sin aktivitet men är ett DNA-reparationsenzym och ger tillväxten i 5'-3'-riktningen med användning av fria 3'-OH-grupper.

DNA-polymeras-III:

Det spelar en viktig roll vid DNA-replikering. Det är ett multimer enzym eller holoenzym som har tio underenheter, såsom a, p, e, θ, г, y, δ, δ ', x och Ψ. Alla dessa tio underenheter är nödvändiga för DNA-replikation in vitro; Men alla har olika funktioner. Exempelvis har a-underenheten 3'-> 5'-exonukleas-korrekturläsning eller redigeringsaktivitet. Kärnenzymet innefattar tre underenheter-a, p och 6. Återstående sju subenheter ökar processiviteten (processivitet betyder snabbhet och effektivitet med vilken ett DNA-polymeras sträcker sig växande kedja).

Eukaryotiskt DNA-polymeras:

Eukai yotes (t ex jäst, råttlever, humana tumörceller) befinns innehålla följande fem typer av DNA-polymeraser:

(i) DNA-polymeras a:

Detta relativt högmolekylära enzymet kallas också cytoplasmatiskt polymeras eller stort polymeras. Det finns både i kärnor och cytoplasma.

(ii) DNA-polymeras p:

Detta enzym kallas också kärnpolymeras eller litet polymeras och finns endast hos ryggradsdjur.

(iii) DNA-polymeras y:

Detta enzym kallas mitokondriepolymeras och kodas i kärnan.

(iv) DNA-polymeras 5:

Detta enzym finns i däggdjursceller och är PCNA beroende av DNA-syntesprocessivitet (PCNA = proliferating cell nuclear antigen).

(v) DNA-polymeras e:

Det var tidigare känt som DNA-polymeras 5II. Detta enzym är PCNA-oberoende och förekommer i däggdjurs HeLa-celler och spirande jäst.

Det stora DNA-polymeraset a är det dominanta DNA-polymerasenzymet är eukaryota celler och troddes under lång tid att vara det enda enzymet som är involverat i DNA-replikation. Men nu befinner sig ett ytterligare polymeras, nämligen DNA-polymeras 8, att vara involverad i eukaryotisk DNA-replikation.

DNA Primers:

Dessa enzymer katalyserar syntesen av RNA-primers som är en förutsättning för initiering av DNA-replikation i de allra flesta av organismerna. Innan den faktiska DNA-replikationen börjar, måste korta RNA-oligonukleotidsegment, som kallas RNA-primers eller helt enkelt primrarna, syntetiseras genom DNA-primasenzym med användning av ribonukleosidtrifosfater.

Denna RNA-primer syntetiseras genom att kopiera en viss bassekvens från en DNA-sträng och skiljer sig från en typisk RNA-molekyl genom att efter syntesen förbli primern vätebindad till DNA-mallen.

Primerna är ca 10 nukleotider långa i eukaryoter och de är gjorda i intervaller på den släpande strängen där de förlängs av DNA-polymerasenzymet för att påbörja varje okazaki-fragment. Dessa RNA-primers skäras senare och fylls med DNA med hjälp av DNA-reparationssystem i eukaryoter.

I bakterier är två olika enzymer kända för att syntetisera primer-RNA-oligonukleotider - RNA-polymeras (på ledsträngen) och DNA-primas (på den nedslående strängen).

Polynukleotidligas:

Detta enzym är ett viktigt enzym både i DNA-replikation och i DNA-reparation. DNA-ligas katalyserar bildningen av fosfodiesterbindning mellan 5'-fosforylgruppen av en nukleotid och 3-OH-gruppen hos den närmaste grannen vid sidan av ett nick i en DNA-sträng; sålunda förseglar det nicks i en DNA-sträng.

endonukleaser:

Endonukleaser, särskilt restriktionsendonukleaser, är också viktiga under DNA-replikation såväl som DNA-reparation. Under DNA-replikation kan ett endoclease producera ett nick i ursprunget för att initiera replikation eller det kan ge upphov till att generera en svängning för att underlätta DNA-avveckling.

Enzymer involverade vid öppnandet av DNA-helix:

DNA-helikaser:

DNA-helikaser är ATP-beroende avlindningsenzymer som främjar separation av de två föräldrasträngarna och etablerar replikationsgafflar som gradvis kommer att flytta bort från ursprunget. Upplindning av mall-DNA-helixen vid en replikationsgaffel kan i princip katalyseras av två DNA-helikaser, som verkar i konsert, en som löper längs den främre strängen och den andra längs den släpande strängen.

Helix-destabiliserande sträng (även kallad enkelsträng-DNA-bindande proteiner eller SSBP):

Bakom replikationsgaffeln förhindras de enskilda DNA-strängarna från att återspola varandra (eller bilda dubbelsträngade hårpinnar i varje enda sträng) genom verkan av SSB-proteiner. SSB-proteiner binder till exponerade DNA-strängar utan att täcka baserna, vilka därför är tillgängliga för templeringsprocessen.

Topoisomeraser (DNA-gyraser):

Verkan av ett helikas introducerar en positiv supercoil i duplex-DNA före replikationsgaffeln. Enzymer, som kallas topoisomeraser, slappna av superkolan genom att fästa vid den transienta supercoil duplexen, nicka en av strängarna och rotera den genom den obrutna strängen. Nicket förseglas sedan.

En typ av topoisomeras (dvs topoisomeras I) orsakar en enkelsträngsbrott eller nick som tillåter de två sektionerna av DNA-helix på vardera sidan av nick för att rotera fritt i förhållande till varandra, med användning av fosfodiesterbindningen i strängen motsatt nicket som en svängpunkt. En andra typ av topoisomeras (dvs topoisomeras II) bildar en kovalent bindning till båda strängarna av DNA-helix samtidigt, vilket gör transient dubbelsträngspaus i helixen.

replikon:

Ett replikon är DNA-enheten i vilken individuella replikationsreaktioner äger rum, det vill säga det kan DNA-replikation oberoende av andra segment av DNA. Därför har varje replikon ett ursprung i vilket replikation initieras och det kan ha en terminus vid vilken replikationen stannar.

De bakteriella och virala kromosomen innehåller vanligen en enda replikon / kromosom. Även om fag T har två ursprung, en primär och en sekundär, men i närvaro av primärt ursprung är sekundärt ursprung i regel icke-funktionellt. I E. coli identifieras ursprungspunkten som genetisk locus oriC.

Ett fullständigt prokaryotiskt ursprung stöder följande tre funktioner: (1) initiering av replikation, (2) kontroll av frekvensen av initieringshändelser och (3) segregeringen av de replikerade kromosomerna i dottercellerna.

Origins har identifierats i bakterier, jäst, kloroplaster och mitokondrier; deras signifikanta allmänt särdrag är att de är A: T-rika som kan vara viktiga för att underlätta avveckling under replikering. Det bakteriella ursprunget innehåller många olika korta (<10 bp) platser som behövs för dess funktion; Dessa platser separeras ibland av specifika avstånd men inte av specifika sekvenser. Dessa specifikt placerade ställen behövs för bindning av olika proteiner som är involverade i DNA-replikation.

Flera prokaryota replikoner har specifika ställen, som kallas terminus, vilket stoppar replikationsgaffelrörelsen och därigenom avslutar DNA-replikation. E. coli-kromosom har två terminii, som kallas Ti och T2, belägna ca 100 Kb på vardera sidan av den punkt där replikationsgafflarna skulle mötas. Varje terminus är specifik för en gaffelrörelse.

Tl och T2 är anordnade på ett sådant sätt att varje gaffel måste passera den andra för att nå den specifika änden. Replikeringstermineringen kräver produkten av tus-gen, som förmodligen koder för ett protein som känner igen T och T2.

I eukaryoter har varje kromosom flera replikoner (t.ex. jäst, 500; Drosophila, 3 500, mus 25 000; Viciafaba, 35 000). Vid någon given punkt under S-fasen genomgår endast några av dessa replikoner replikering; varje replikon verkar aktiveras vid en specifik tid i en specifik sekvens. Längden av ett eukaryot replikon kan variera från 40 Kb i jäst och Drosophila till ca 300 Kb i Vicia.

Antalet detekterbara replikoner verkar variera med utvecklingsstadiet och cellen eller vävnadstypen. Detta förklaras på grundval av vävnadsspecifikt ursprung så att vissa ursprung är aktiva i vissa vävnader, medan andra är aktiva i vissa andra vävnader.

Detta exemplifieras av Drosophila där de tidiga embryonala cellerna har 10 gånger så många replikoner som de i de vuxna somatiska cellerna. Tillgängliga bevis tyder på att eukaryota replikoner inte har terminii.

Replikens trohet:

Frekvensen för DNA-replikation är mycket lägre än den för transkription på grund av behovet av att bevara betydelsen av det genetiska meddelandet från en generation till nästa. Till exempel är den spontana mutationshastigheten i E. coli cirka ett fel per 10 ¹⁰ baser inkorporerade under replikation.

Detta beror främst på närvaron av de mindre tautomera formerna av baserna som har förändrade basparningsegenskaper. Felprocenten minimeras av en mängd olika mekanismer. DNA-polymeraser kommer endast att inkorporera en inkommande nukleotid om den bildar det korrekta basparet med mallnukleotiden i dess aktiva plats.

Det tillfälliga felet detekteras av 3 '-> 5' korrekturreferensexonukleas associerat med polymeraset. Detta avlägsnar den felaktiga nukleotiden från 3'-änden före någon ytterligare inkorporering, så att polymeraset sedan sätter in den rätta basen. För att korrekturläsningsexonukleas ska fungera korrekt måste det kunna skilja ett korrekt baspar från en felaktig.

Den ökade rörligheten hos "unanchored" baspar vid själva 5'-änden av nyligen initierade DNA-slagsfragmentfragment innebär att de aldrig kan visas korrekt och så kan inte korrekturläsas. Följaktligen är de första nukleotiderna ribonukleotider (RNA) så att de senare kan identifieras som lågtrohetsmaterial och ersättas med DNA långsträckt (och korrekturläst) från det intilliggande fragmentet. Fel som lämnar korrekturläsning korrigeras av en felparametrar.

Mekanism för DNA-replikation i prokaryoter:

In vitro DNA-replikation har studerats omfattande i E. coli och i fagerna och plasmiderna av E. coli. I E. coli involverar processen för DNA-replikation följande tre huvudsteg:

1. Initiering av DNA-replikation:

Denna process innefattar tre steg: (i) igenkänning av ursprunget (O), (ii) öppning av DNA-duplex för att alstra en region av enkelsträngad DNA, och (iii) infångning av DNA-B-protein (dvs 5'3'-helikas ; fungerar också som aktivatorn av primas). Således binder ATP-komplexet med Db-A (eller initiatorprotein) vid 9 bp inverterade upprepningsregioner (R,, R,, _RvR ) i oriC av E. coli och främjar öppning av DNA-duplexet i en region av tre direkta upprepningar av 13-bp-sekvensen (kallad 13-mer).

Öppningen sker från höger 13-mer till vänster och kräver negativt supercoiled DNA- och HU- eller IHF-initiatorproteiner. Dna B (-helicas) överförs till exponerat enkelsträngat DNA och orsakar avveckling av DNA i närvaro av A TP, SSB-protein och DNA-gyrase (ett topoisomeras).

Detta resulterar i avveckling av DNA-duplex och replikationen från ori C fortsätter i båda riktningarna (dubbelriktad); SSB-bindning sker på enkelsträngade områden och två Dna B-komplex (= primosomer) laddas på varje sträng.

2. Förlängning av DNA-kedjan:

Detta steg kräver närvaron av följande enzymer och faktorer: 1. Dna B eller helikas (även kallad mobilpromotor); 2. primas (Dna G); 3. DNA-polymeras holoenzym (eller DNA-pol IIIHU); 4. SSB-protein; 5. RNAas H som avlägsnar RNA-primers; 6. DNA-polymeras I som används för att fylla gapet skapat på grund av RNA-primers och 7. DNA-ligas (som omvandlar primerfria okazakafragment till kontinuerlig sträng). Under initiering till förlängningsövergång sker följande händelser:

(i) När helikas (eller Dna B) färdas i 5'-> 3 'riktning genererar den en replikationsgaffel genom att öppna DNA-duplexen.

(ii) DNA-strängen som har helikas blir den släpande strängen. DNA-primas associerar med Dna B-helikas, vilket bildar primosomen som syntetiserar multipla primers för lagringsträng och enkel RNA-primer för ledsträngen.

(iii) För syntesen av lagsträngen måste DNA-pol III HE arbeta på samma sträng som Dna B-helicas är bunden, men det rör sig i motsatt riktning.

(iii) DnaB helikas, DNA-gprimas och DNA-pol III FIE arbetar tillsammans i strängförlängning. Helicas- och DNA-polymerasaggregatet förblir processivt, dvs de är tätt bundna till gaffeln och förbli bundna genom reaktionen.

Syntes (förlängning) av släpande och ledande strängar sker med något olika metoder; det är mycket mer komplext för lagringsträng än för den främsta strängen:

(A) Discontinuous synthesis on lagging strand:

1. Primas tas upp från lösningen och aktiveras av helikas (DnaB) för att syntetisera aRNA-primer (10 till 20 nt eller nukleotider lång) på den släpande strängen.

2. RNA-primrarna känns igen av DNA-pol IIIHU på den lagrande strängen och används för syntes av prekursor- eller okazakafragment. Faktum är att varje ny RNA-primer känns igen av gamma (y) -enheten av DNA-pol IIIH och laddad med p-subenheten av samma polymeras. Denna förladda p-underenhet kan då fånga kärnan av DNA-poly III HE när den blir tillgänglig efter avslutning av sitt syntetiska jobb på föregående okazaki-fragment.

3. Vid fullbordandet av okazakafragmenten exciteras RNA-primrarna av DNA-polymeras 1, som sedan fyller de resulterande luckorna med DNA.

4. Efter DNA-polymeras lägger jag till de slutliga deoxiribonukleotiderna i gapet som lämnas av den exciterade primeren, enzymin DNA-ligas fonnerar fosfodiesterbindningen som förbinder den fria 3'-änden av primerutbytet till 5'-änden av okazaki-fragmentet.

(B) Kontinuerlig syntes på ledande sträng:

1. Vid dubbelriktad DNA-replikation primeras den främre strängen en gång på var och en av de föräldrasträngarna.

2. RNA-primern i den ledande strängen syntetiseras av RNA-polymerasenzym.

3. DNA-pol III HE orsakar förlängning av den ledande strängen och slutligen DNA-pol 1 och ligas enzymer ger slutlig beröring till ledsträngen som vid fallande strängen.

DNA-replikering i eukaryoter :

Eukaryotisk DNA-replikation kräver två olika DNA-polymerasenzymer, nämligen DNA-polymeras a och DNA-polymeras 5. DNA-polymeras 6 syntetiserar DNA-en på ledande strängen (kontinuerlig DNA-syntes), medan DNA-polymeras a syntetiserar DNA-en på den lagrande strängen (diskontinuerlig DNA-syntes). Förutom dessa två enzymer, DNA-replikation: (1) T-antigen; (2) replikationsfaktor A eller RF-A (även kallad RP-A eller eukaryot SSB); (3) topoisomeras I; (4) topoisomeras II; (5) proliferativ cell-nukleär antigen (PCNA, även kallad cyklin), och (6) replikationsfaktor Cor RF-C.

Processen med eukaryotisk DNA-replikation innefattar följande steg:

1. Före inledandet av DNA-syntesen föreligger ett presynthetiskt stadium av 8-10 minuters varaktighet för bildningen av det vikna DNA-komplexet. Detta steg behöver endast tre renade proteiner, nämligen T-antigen (T-ag eller tumörantigen), RF-A och topiosomeraser I och II.

2. T-antigenet, som använder sin DNA-bindande domän, bildar ett multi-subenhetskomplex med plats I och plats II i närvaro av A TP och orsakade lokal avveckling.

3. Mer omfattande duplexavveckling sker på grund av association av RF-A och ett topoisomeras med hjälp av DNA-helikasskomponent av T-sedan Topoisomeraser hjälper till att avveckla DNA genom att ändra DNA-topologi vid replikationsgaffeln.

4. RF-A eller SSB-proteiner binder till avlindat enkelsträngat DNA.

5. Primer-RNA-syntesen utförs av primas som är tätt associerad med DNA-polymeras ex.

6. DNA-polymeras a hjälper vid syntes av ett okazaki-fragment i 5 'till 3'-riktning.

7. Replikeringsfaktor C (eller RF-C) och PCNA (cyklin) hjälper till att byta DNA-polymeraser så att pol a ersätts med pol 5, som sedan kontinuerligt syntetiseras DNA på ledsträngen.

8. Ett annat okazaki-fragment syntetiseras sedan från replikationsgaffeln på den lagrande strängen av pol a-primaskomplexet och detta steg upprepas om och om igen tills hela DNA-molekylen är täckt.

9. RNA-primrarna avlägsnas och luckorna fylls som vid prokaryotisk DNA-replikation.

Nyligen har DNA-polymeras e-roll i DNA-replikation betonats, så att tre DNA-polymeraser (a, 5 och e) nu är kända för att vara involverade i eukaryotisk DNA-replikation. A. Sugino och medarbetare har föreslagit att DNA-polymeras a kan fungera vid både ledande och bakre strängar (eftersom polymeras a har a-primasaktivitet), medan polymeras e och polymeras 5 är involverade i förlängning av respektive ledande och bakre strängar.

DNA-skador och reparationsmekanism

Typer av DNA-skada:

1. DNA-skador:

En förändring i DNA: s normala kemiska eller fysiska struktur kallas DNA-lesioner. Många exogena ämnen, såsom kemikalier och strålning, kan orsaka förändringar i kväve- och kolatomernas positioner i basens heterocykliska ringsystem och några exocykliska funktionella grupper (dvs. basens keto och aminogrupper).

Detta kan leda till förlust av basparning eller förändrad basparning (t.ex. ett ändrat A kan basparet med C istället för T). Om en sådan lesion tillåts att förbli i DNA kan en mutation fixeras i DNA genom direkt eller indirekt mutagenes.

Alternativt kan den kemiska förändringen ge en fysisk distorsion i DNA som blockerar replikation och / eller transkription, vilket orsakar celldöd. Således kan DNA-lesioner vara mutagena och / eller dödliga. Vissa skador är spontana och uppstår på grund av DNA-inneboende kemisk reaktivitet och närvaron av normala reaktiva kemiska arter inom cellen.

Till exempel genomgår bascytosinet spontan hydrolytisk deaminering för att ge uracil. Om det lämnas oreparerat skulle den resulterande uracilen bilda ett baspar med adenin under efterföljande replikation, vilket ger upphov till en punktmutation. Depurination är en annan spontan hydrolytisk reaktion som innefattar spjälkning av N-glykosylbindningen mellan N-9 i purinbaserna A och G och C-1 'i deoxiribosocker och därmed förlust av purinbaser från DNA: n. DNA-sockerfosfatets ryggrad kvarstår intakt. Den resulterande apuriniska platsen är en icke-kodande lesion, eftersom information kodad i purinbaserna förloras.

2. Oxidativ skada:

Detta sker under normala förhållanden på grund av närvaron av reaktiva syrearter (ROS) i alla aeroba celler, exempelvis superoxid, väteperoxid och, viktigast av allt, hydroxylradikalen (OH). Denna radikala kan attackera DNA, jag på ett antal punkter, som producerar en rad oxidationsprodukter med förändrade II egenskaper, till exempel 8-oxoguanin, 2-oxoadenin och 5-formyluracil. Nivåerna av dessa kan ökas med hydroxylradikaler från radiolys av vatten som orsakas av joniserande strålning.

3. Alkylering:

Alkyleringsmedel är elektrofila kemikalier som lätt tillsätter alkyl (t.ex. metyl) grupper till olika positioner på nukleinsyror, skilda från de som metyleras av normala metylerings-enzymer. Vanliga exempel är metylmetansulfonat (MMS) och etylnitrosourea (ENU).

Typiska exempel på metylerade baser är 7-metylguanin, 3-metyladienin, 3-metylguanin och O-metylguanin. Några av dessa lesioner är potentiellt dödliga eftersom de kan störa avvecklingen av DNA under replikation och transkription. De flesta är också indirekt mutagena; 0-metylguanin är emellertid en direkt mutagen lesion eftersom den kan basera med tymin under replikation.

4. Bulky addukter:

Cyklobutanpyrimidindimerer bildas genom ultraviolett ljus från intilliggande pyrimidiner på en sträng genom cyklisering av de dubbelbundna C5- och C6-kolatomerna i varje bas för att ge en cyklobutanring. Den resulterande förlusten av basparning med den motsatta strängen medför lokaliserad denaturering av DNA som producerar en skrymmande lesion som skulle störa replikation och transkription. En annan typ av pyrimidindimer, 6, 4-fotoprodukten, härrör från bildningen av en bindning mellan C6 i en pyrimidinbas och C4 i den intilliggande basen.

När koltjärnen cancerframkallande benso [a] pyren metaboliseras av cytokrom P-450 i levern kan en av dess metaboliter (en diol epoxid) bindas kovalent till 2-aminogruppen av guaninrester. Många andra aromatiska aryleringsmedel bildar kovalenta addukter med DNA. Levercancerogena aflatoxin B binder också kovalent till DNA.

DNA Reparation:

Reparationssystemen känner igen en mängd förändringar i DNA för att initiera åtgärder. En cell kan ha flera system för att hantera DNA-skador. Dessa system innefattar följande: (1) Direkt reparation, (2) Reparation av exklusioner (3) Reparation av motparter, (4) Toleranta system och (5) Återvinningssystem.

1. Direkt reparation:

Omvändning eller enkel avlägsnande av skadan på DNA är känd som direktreparation, t ex avlägsnande av de kovalenta bindningarna mellan de två 4 och två 5 kolatomerna i de två tyminresterna som deltar i bildningen av tymindimerer.

Tymdimerer bildas generellt på grund av UV-bestrålning och stör replikation och transkription. Kelner (1949) observerade att ett stort antal bakterier kunde överleva stora doser av UV-strålning; om de utsattes för en intensiv källa av synligt ljus.

Detta fenomen kallas fotoreaktivering. Det visades senare att vid en UV-bestrålning binds ett visst enzym selektivt till bakterie-DNA. Under fotoreaktiveringsprocessen aktiveras enzymet av det synliga ljuset. Det spjälkar de tymin dimererna, vilket gör att de återställs till sin ursprungliga form. Denna reparationsprocess är enzymmedierad och ljusberoende.

2. Excisionsreparation:

I denna reparationsmekanism skäras det skadade eller förändrade segmentet av DNA-strängen och en ny DNA-patch syntetiseras i sin plats. Även om excisions reparationssystem varierar i deras specificitet, innefattar huvudvägen följande tre steg:

(i) Erkännande och Incision:

Den skadade / förändrade sektionen av en DNA-sträng känns igen av ett endonukleas; detta enzym skär sedan den drabbade strängen på båda sidorna av skadorna.

(ii) Excision:

En 5'-> 3 'exonukleas (DNA-polymeras I) digerer bort det skadade / förändrade avsnittet; detta genererar en enkelsträngad region i DNA-dubbelhelixen.

(iii) Syntes:

I detta steg tjänar den enkelsträngade regionen som produceras genom excision som en mall för ett DNA-polymeras som syntetiserar ersättningen för det utskurna segmentet. DNA-ligas förseglar sedan nicket som förblir efter syntesen av utbytet för den utskurna sektionen.

I E. coli är excisionen troligen på grund av 3 '-> 5' exonukleasaktiviteten hos DNA-polymeras I, medan syntes uppnås genom 5'-> 3'-polymerasaktiviteten hos samma enzym. Excisionsreparationssystemen är ganska vanliga både i prokaryoter och eukaryoter. Några av dessa system känner igen allmän skada på DNA, medan andra är mycket specifika, t ex AP-endonukleaser avlägsnar ribosresterna från depureringsställena. Excisionsreparation innefattar olika längder av DNA och grupperas i följande tre klasser:

(a) Mycket kort plåster reparation (VSP):

Detta system behandlar reparation av felaktigheter mellan specifika baser.

(b) Kort patch-reparation:

I detta system skärs omkring 20 baser lång DNA-sträng och skadorna repareras genom uvr-gener (uvr, A, B, C, E. coli), som kodar för komponenter i ett reparationsendonukleas. Ett annat enzym uvr D behövs också för helicasaktivitet.

(c) Lång reparation av plåstret:

Detta system innefattar excision av ca 1500 bas långa segment, men ibland kan det utskurna segmentet vara> 9000 baser. Det är mycket mindre vanligt och måste induceras av skador som blockerar replikation. I E. coli involverar detta system även uvr-generna och DNA-polymeraset I.

3. Mismatch Repair:

Det handlar om korrigering av felaktigheter eller parning mellan baser som inte är komplementära. Mismatcher kan uppstå antingen (a) under replikation eller (b) på grund av basförändringar (t.ex. deaminering av cytosin till uracil) och resulterar i strukturella snedvridningar i DNA: s dubbla helix. Dessa växlingar hanteras i E. coli med det mycket korta patch-excisionsreparationssystemet som beskrivs nedan.

Mismatch Repair System i E. coli:

När det finns en felmatchning i ett baspar som i GC -> GT, kan det teoretiskt repareras för att ge upphov till antingen vildtyp (GC) eller mutanttyp (AT). Därför måste reparationssystemet skilja mellan gamla och nya strängar och reparera endast den nya strängen för att återställa vildtypen.

Detta görs med ett mycket snabbt patch-excisionsreparationssystem och kräver fyra proteiner, nämligen Mut L, Mut S, Mut U och Mut H kodade i E. coli respektive genom gener mut L, mut S, mut U och mut H. Felparametrationsfel som produceras under replikering korrigeras av dammreparationssystem.

Gen-dammen från E. coli producerar en metylas som metylerar adenin av sekvens GATC på båda DNA-strängarna. Replikationen av en fullständigt metylerad GATC-sekvens ger en hemimetylerad sekvens, i vilken A-resterna i de nyssyntetiserade strängarna är icke-metylerade.

Det icke-metylerade tillståndet för denna målsekvens används för att identifiera den nya strängen; baserna kring felaktighetsplatsen i den nya strängen skärs ut och en ersättare syntetiseras. Systemet involverar produkterna av gener mut L, mut S, mut H och uvr D.

Återhämtningssystem Reparationer:

Dessa system är också kända som "reparation efter replikering" eller "rekombinationsreparation". I E.coli är detta reparationssystem baserat på rec A-genen som producerar Rec A-proteinet. Rec Ett protein fungerar i utbytet av strängar mellan DNA-molekyler under genetisk rekombination och fungerar också i singelsträngsbytet under rekombinationsreparation. Det verkar finnas två rec A-vägar, en som involverar rec B, C-generna och den andra som inbegriper rec F.

Detta reparationssystem fungerar när en strukturförvrängning blockerar replikering vid den skadade platsen. Till exempel kan E. coli-mutanter som saknar excisionsreparation inte kunna ta bort tymindimerer. I en sådan situation fortsätter replikationen normalt upp till de skadade platserna; DNA-polymeras stoppar replikationen av den drabbade strängen och initierar replikering som hoppar över den skadade platsen.

Komplementärsträngen replikeras normalt på den skadade platsen i den andra strängen. Därför ger replikation ett normalt avkomma av DNA-molekylen och en molekyl med tymindimer i en sträng och ett långt gap i sin komplementära sträng. Avkomma-DNA-molekylen med tymin-dimer skulle gå vilse om den inte repareras genom att fylla gapet i en av dess strängar.

Detta uppnås genom enkelsträngsbyte mellan de två avkomma-DNA-molekylerna; Utbytesområdet fyller gapet och induceras av Rec A protein. Som ett resultat av denna utbyte har den normala avkommarmolekylen en enkelsträngad region som har ett gap. Detta mellanrum repareras genom DNA-syntes.

Toleranssystem:

Dessa system hanterar de skador som blockerar normal replikering vid den skadade platsen möjligen genom att tillåta replikering av de skadade platserna med en hög frekvens av fel. Dessa system kan vara särskilt viktiga i eukaryoter där genomstorleken är mycket stor och därför är en fullständig reparation av skadan ganska osannolik.