DNA-replikation: DNA-replikationsmekanismer

Några av de viktigaste sätten för DNA-replikering är som följer!

DNA-replikation i eukaryoter är semikonservativ, halvdiskontinuerlig och dubbelriktad jämfört med semikonservativ, dubbelriktad och kontinuerlig i prokaryoter.

Image Courtesy: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

DNA-replikation sker under S-fasen av cellcykeln. Det är en multistep komplex process som kräver över ett dussin enzymer och proteinfaktorer. Det börjar vid en viss plats som kallas replikation eller ori. Bakteriellt och viralt DNA har ett enda replikationsstart. Det fungerar som en enda replikeringsenhet eller replikon.

I eukaryot DNA finns ett antal replikationsstart. Den har flera replikerande segment eller replikoner, dvs multirepliconic. I avsaknad av ori, kommer replikation inte att ske. Kravet på en vektor för rekombinant DNA-teknik är att erhålla replikationsstart.

Replikation av DNA är energiskt mycket dyrt. Det huvudsakliga enzymet för DNA-replikation är DNA-beroende DNA-polymeras. DNA-replikation är ganska snabb. Replikationen av DNA från E. coli med 4, 6 x 106 bp kräver 19 minuter.

Med en genomsnittlig polymeriseringsgrad av baser är 2000 bp per sekund i varje riktning. Replikation kräver riklig energi som kommer från nedbrytning av trifosfater av deoxiribonukleotider.

Replikationen sker enligt följande:

1. Aktivering av deoxiribonukleotider:

Deoxiribonukleotider eller deoxiribonukleosidmonofosfater förekommer fritt inuti nukleoplasman. De är av fyra typer-deAMP (deoxyadenosinmonofosfat), deGMP (deoxyguanosinmonofosfat), deCMP (deoxycytidinmonofosfat) och deTMP (deoxitymidinmonofosfat). De fosforforeras först och ändras till aktiva former som har tre fosfatrester istället för en. Enzymer fosforylas krävs tillsammans med energi.

De fosforylerade nukleotiderna är deATP (deoxiadenosintrifosfat), deGTP (deoxyguanosintrifosfat), deCTP (deoxycytidintrifosfat) och deTTP (deoxitymidintrifosfat). Dessa trifosfater av baser tjänar dubbelt syfte. De fungerar som substrat samt tillhandahåller energi för polymerisation av nukleotider.

2. Exponering av DNA-strängar:

Enzymhelikas (unwindase) verkar över Ori-stället och unzips (unwind) de två strängarna av DNA genom att förstöra vätebindningar. De separerade strängarna stabiliseras med hjälp av enkelsträngade bindningsproteiner (SS BP) eller helixstabiliserande proteiner. Unwinding skapar spänning i den ospolade delen genom att bilda fler supercoils. Spänning frigörs av enzymer topoisomeraser.

De orsakar nicking och återföring av DNA-strängen. Tillsammans med topoisomeras har bakterier ett annat enzym som heter DNA-gyrase som kan introducera negativa supercoils (äldre arbetare trodde att gyrase fungerade både för helikas och topoisomeras).

Med hjälp av olika enzymer blir båda DNA-strängarna öppna för replikation. Hela DNA öppnas emellertid inte i en sträckning på grund av mycket högt energibehov. Separationspunkten går långsamt mot båda riktningarna. I varje riktning ger det utseende av Y-formad struktur som kallas replikationsgaffel (fig 6.13 och 6.14).

3. RNA-primer:

Det är viktigt för initiering av nya DNA-kedjor. RNA-primer är en liten strand av RNA som syntetiseras vid 5'-änden av den nya DNA-strängen med hjälp av DNA-specifikt RNA-polymerasenzym som kallas primas. RNA-primer bildas på den fria änden av en sträng och gaffeländen på den andra strängen. Bildandet av RNA-primer utgör initieringsfasen för DNA-syntesen, eftersom dna-polymeraser inte kan tillsätta nukleotider utan närvaro av RNA-primer.

Ett mer komplext enzym som kallas primo en del krävs i fag ф x 174 och några andra prokaryota system. I eukaryoter utförs primasfunktionen av enzym-DNA-polymeras a. Det bygger upp ~ 10 bas RNA och 20-30 baser av DNA (Lewin, 2004). Efter start av nukleotidkedjan avlägsnas RNA-primer och gapet fylls av DNA-polymeras I i prokaryoter och DNA-polymeras P i eukaryoter.

4. DNA-polymeraser:

Prokaryoter har tre huvudtyper av DNA-syntetiserande enzymer som kallas DNA-polymeraser III, II och I. Alla adderar nukleotider i 5'-> 3'-riktningen på 3'-> 5'-sträckningen av modersträngen. De har också 3 '-> 5' exo-nukleasaktivitet. Medan DNA-polymeras III huvudsakligen är involverat i DNA-replikation (tillsats och polymerisation av nya baser) är polymeras I ett stort reparationsenzym. Polymeras II är mindre reparationsenzym.

DNA-polymeras I har också 5 -> 3 exonukleasaktivitet. I eukaryoter hittas fem typer av DNA-polymeraser-a, p, y, 5 och e, men de viktigaste tre är a, 5 och e. Polymeras 8 är involverad i replikation av ledande sträng. Polymeras kan hjälpa till vid syntes av släpande sträng alongwith andra roller. Polymeras a är det största och största replikationsreaktionen av DNA. Alla DNA-polymeraser har en konfiguration av gripande hand med tummen på ena sidan, fingrar på den andra och palmen som konkav katalytisk plats för att kombinera mall och baspar.

5. Basparning:

De två separerade DNA-strängarna i replikationsgaffeln fungerar som mallar. Deoxiribonukleosidtrifosfater kommer att ligga mitt emot kvävebaserna av exponerade DNA-mallar - deTTP motsatt A, deCTP motsatt G, deATP motsatt T och deGTP motsatt C.

Nukleofil angrepp separerar ett pyrofosfat (PPi) från trifosfatet. Fosfodiesterbindningar är etablerade. Hydrolys av pyrofosfat genom enzympyrofosfatas frigör energi. Deoxyribouncleosidtrifosfat → Deoxirribouncleosidmonofosfat + PPi

Energin används för att etablera vätebindningar mellan de fria nukleotiderna och kvävebaserna av mallar.

6. Kedjeformation:

Det kräver DNA-polymeras III (Kornberg, 1956) i prokaryoter och polymeras 5 / e i eukaryoter. DNA-polymeras III är ett komplext enzym med sju underenheter (a, p, →, €, θ, t). I närvaro av Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP och DNA-polymeras III, fastställs de intilliggande nukleotiderna som är fästa vid kvävebaser av varje mall-DNA-sträng, fosfodiesterbindningar och får kopplas till att bilda replikerad DNA-sträng.

När replikationen fortskrider, släpper och separerar nya områden av DNA-duplex för föräldrar så att replikationen fortskrider snabbt från ursprungsorten till den andra änden. RNA-primeren avlägsnas och gapet fylls med komplementära nukleotider med hjälp av DNA-polymeras I. På grund av sekventiell öppning av DNA-dubbelkedjan och dess replikation för att bilda två kedjor kallas DNA-replikation även blixtlåsdubbling.

DNA-polymeras kan emellertid polymerisera nukleotider endast i 5'-3'-riktningen på 3'-> 5'-strängen eftersom det adderar dem vid 3'-änden. Eftersom de två strängarna av DNA löper i antiparallella riktningar, tillhandahåller de två mallarna olika ändar för replikering. Replikering över de två mallarna fortsätter sålunda i motsatta riktningar. En sträng med polaritet У -> 5 'bildar dess komplementära sträng kontinuerligt eftersom 3'end av den senare är alltid öppen för töjning.

Det kallas ledande sträng. Replikering är diskontinuerlig på den andra mallen med polaritet 5 '→ 3 eftersom endast ett kort segment av DNA-strängen kan byggas i 5' → 3-riktning på grund av exponering av en liten mallsträcka i taget. Korta segment av replikerat DNA kallas Okazaki-fragment (= Okasaki-segment, Reiji Okazaki, 1968). Var och en av dem har 1000-2000 bp i prokaryoter och 100-200 bp i eukaryoter.

En RNA-primer krävs också varje gång ett nytt Okazaki-fragment ska byggas. Efter ersättning av RNA-primer med deoxiribonukleotider och deras polymerisation förenas Okazaki-fragment tillsammans med enzym, DNA-ligas (Khorana, 1967). DNA-sträng uppbyggd av Okazaki-fragment kallas försvagande sträng.

Eftersom en sträng växer kontinuerligt medan den andra strängen bildas diskontinuerligt är DNA-replikation halvdiskontinuerlig. Eftersom replikation fortsätter tvåriktat från ursprunget för replikation eller ori, bildar en föräldersträng en ledande sträng på ena sidan och slingrande sträng på den andra sidan. Det omvända förekommer på de andra sidans överordnade strängar. Detta hjälper till att fylla i replikering samtidigt i hela replikonet.

7. Bevisläsning och DNA-reparation:

En fel bas införs ibland under replikering. Frekvensen är en på tio tusen. DNA-polymeras III kan känna av samma. Den går tillbaka, tar bort fel bas, tillåter tillsättning av korrekt bas och fortsätter sedan framåt. Men även DNA-polymeras III kan inte skilja uracil från tymin så att det ofta införlivas i stället för tymin. En sådan mismatching korrigeras med hjälp av ett antal enzymer.

Det finns en separat reparationsmekanism för eventuell skada som orsakas av DNA på grund av mutation, UV-exponering eller otillbörlig matchning som släpper ut korrektläsningsmekanism. Ett nick eller paus orsakas av ett endonukleas i närheten av reparationsområdet. DNA-polymeras I (Komberg, 1969) avlägsnar de felaktiga eller felaktiga nukleotiderna om de är närvarande och syntetiserar en korrekt ersättning genom att använda den intakta strängen som mall. Det nybildade segmentet förseglas av DNA-ligas.