Deoxiribonukleastest på bakterier för att ta reda på deras förmåga att hydrolysera DNA (med figur)

Deoxiribonukleas-test (DNas-test) på bakterier för att ta reda på deras förmåga att hydrolysera DNA (med figur)!

Princip:

Vissa bakterier har förmågan att hydrolysera deoxiribonukleinsyra (DNA) till oligonukleotider, eftersom de kan producera det extracellulära hydrolytiska enzymet "deoxiribonukleas" (DNas).

Medan DNA: n blir utfällt genom att producera opacitet med saltsyra, får de hydrolyserade slutprodukterna, oligonukleotiderna, inte utfällas med saltsyra, för vilka de inte producerar sådan opacitet; snarare skapa öppenhet.

I DNas-testet odlas testbakterierna på agarplattor innehållande DNA. Efter att bakteriernas kolonier är synliga, överskrids plattorna med saltsyra. Om bakterierna har förmåga att hydrolysera DNA, hydrolyserar dess kolonier DNA i mediet i de områden som omger dem, medan resten av plattorna innehåller ohydrolyserade DNA.

Som en följd därav bildas genomskinliga klara zoner runt kolonierna när de översvämmas med saltsyra, eftersom de hydrolyserade produkterna, oligonukleotider, som bildas kring dem, inte bildar utfällningar med saltsyran.

Å andra sidan blir resten av plattorna områden ogenomskinliga, eftersom det ohydrolyserade DNA i dessa områden bildar utfällningar med saltsyran. Om toluidinblått används istället för saltsyra, produceras en rosa rosa halo endast runt kolonierna.

Material som krävs:

Petriskålar, konisk kolv, bomullspluggar, inokuleringsslinga, autoklav, bunsenbrännare, laminärflödeskammare, kassera burk, inkubator, DNase agar, IN saltsyra (eller 0, 1% toluidinblå), isolerade kolonier eller rena kulturer av bakterier.

Procedur:

1. Två petriskålar städas, täckas med hantverkspapper och binds med tråd eller gummiband (Figur 7.23). Detta steg såväl som steriliseringen av petriskålarna i steg 6 utelämnas om ugnssteriliserade petriskålar används direkt.

2. Beståndsdelarna i DNasagarmedium (innehållande DNA som huvudkomponent) eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv genom skakning och virvling.

3. Dess pH bestäms med hjälp av ett pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 2 med 0, 1 N HCI om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre.

4. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt.

5. Kolven är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. De två petriskålarna och den koniska kolven innehållande DNase agar-medium steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

7. Efter sterilisering avlägsnas de från autoklaven och får svalna under en tid utan att mediet solidiseras. Kylning av mediet förhindrar kondens och ackumulering av vattendroppar inuti plattorna. Om mediet redan har beretts och stelnat under lagring, måste det vara flytande genom att värma försiktigt tills det smälter fullständigt.

8. För att framställa DNase-agarplattor, kyles och solidifieras det steriliserade DNas-agarmediet i varmt smält tillstånd, aseptiskt, företrädesvis inuti en laminär strömningskammare, i de två steriliserade petriskålarna (ungefär 20 ml vardera), så att Det smälta mediet täcker helt ned petriskålen.

Därefter täcks plattorna med sina lock och får svalna för att stelna mediet i dem. Vattendamp som kan kondensera på plattans och lockens inre yta avdunstas genom att hålla plattorna och locken i inverterad position i en inkubator vid 37 ° C under ca 1 timme.

9. Varje platta är märkt på undersidan till fyra fjärdedelar.

10. "Spotinoculation" av testbakterierna görs aseptiskt, företrädesvis inuti en laminärflödeskammare, i mitten av varje kvart genom att göra en fläck (eller smet) av bakterierna med hjälp av en flamsteriliserad slinga. Slingan steriliseras efter varje ympning.

11. De inokulerade plattorna inkuberas i inverterad position, nedtill, vid 37 ° C i 24 till 48 timmar i en inkubator tills kolonierna hos bakterierna är synliga.

12. Plattorna översväms med lösning av 1 N saltsyra (eller 0, 1% toluidinblå).

observationer:

1. Transparenta klara zoner (eller rosa halo) som bildas runt kolonier: DNase positiv.

2. Transparenta klara zoner (eller rosa halo) som inte bildas runt kolonier: DNas negativ.