Odling av bakterier från fasta, flytande och svampprover (med figur)

Ändamål:

De främsta syftet med odling av bakterier är följande:

1. Öka antalet bakterier för att få dem i synliga former, som kolonier eller suspensioner.

2. Isolering av bakterier.

3. Underhåll av ren stamkultur och standardkulturer.

4. Uppräkning av bakterier i prover.

5. Detektion av särskilda bakterier av intresse i ett prov och dess uppräkning.

6. Identifiering av bakterier från koloniekarakteristika, tillväxtegenskaper på snedställningar och biokemiska aktiviteter i olika medier.

Syftet med detta experiment är dock endast att odla bakterier från flytande, fasta och ytprover i fast och flytande medium för att få dem i synliga former som kolonier respektive suspension.

Princip:

Bakterier odlas i steriliserad, näringsrikt rik flytande eller fast medium. Vätskemediet, kallat buljong, finns i provrör för att bilda "buljongrör", medan det fasta medlet, kallat agarmedium, finns i petriskålar för att bilda "agarplattor" eller helt enkelt "plåtar". Odling av bakterier behöver lite material, som misstänks innehålla bakterier.

De flesta av de saker vi ser innehåller bakterier. De är närvarande i tänder skrapa, mat, jord, vatten, fecal materia och även i de osteriliserade mikrobiologiska medierna själv. En bestämd mängd av den homogena suspensionen av något av det bakterieinnehållande materialet ympas in i steriliserat medium aseptiskt och inkuberas i en inkubator vid 37 ° C under 24 timmar.

I flytande buljong växer bakterierna som suspension och gör det grumligt. På fasta agarplattor växer de som kolonier; varje koloni växer från en enda bakterie. Odling av bakterier görs i följande fem steg.

1. Framställning av media

2. Sterilisering av media och glasvaror

3. Inokulering

4. Inkubation

5. Observation

1. Förberedelse av media:

Vanligtvis, vid beredning av flytande buljong och halvfasta medier vägs ingredienserna i de föreskrivna proportionerna och löses i den erforderliga mängden vatten. För närvarande finns färdiga medelpulver innehållande beståndsdelarna i erforderliga proportioner tillgängliga.

Vid framställning av flytande buljongmedium vägs den föreskrivna kvantiteten pulver (som nämns på etiketten på förpackningen) och löses i den erforderliga mängden vatten i en konisk kolv. Ingredienserna löses upp genom uppvärmning, hälles i provrör och steriliseras i autoklav.

Men vid beredning av fasta plattor, snedställningar och djupröror vägs den föreskrivna kvantiteten pulver (som nämns på etiketten på förpackningen) och löses i önskad mängd vatten i en konisk kolv. Detta preparerade medium steriliseras först i autoklav och får därefter svalna under en tid.

Medan det fortfarande är varmt, innan det stelnar, hälls det i steriliserade petriskålar eller provrör och får stelna vid kylning till rumstemperatur. Media, i mycket varmt skick, ska aldrig hällas i behållare, eftersom det leder till kondensering av vatten på behållarens vägg, vilket faller på ytan av mediet och kan leda till förorening.

2. Sterilisering:

Glasvaror steriliseras i varmluftsugn vid 180 ° C i 3 timmar och media i autoklav vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter. Glassware kan också steriliseras i autoklav, men media bör aldrig steriliseras i ugnen, eftersom vatten släpper ut från media och dehydreras.

3. Inokulering:

Vätskeprover antas vara homogena suspensioner av bakterier. För odling i buljong pipetteras en bestämd volym av provet in i buljongen aseptiskt. För odling på agarplattor pipetteras en bestämd volym av provet på den fasta agarplattan och spridas på ytan av mediet aseptiskt.

För fasta prov homogeniseras ett prov av bestämd vikt aseptiskt i en bestämd volym normal fysiologisk saltlösning (0, 85% natriumklorid) med användning av en steriliserad pestel och mortel eller en bländare. De flesta av de mänskliga patogenerna är isotoniska mot människokroppen (0, 85% natriumklorid).

Vanligen är förhållandet mellan prov och saltlösning 1: 9 (1 g + 9 ml, 10 g + 90 ml, 25 g + 225 ml eller 50 g + 450 ml). En bestämd volym av denna homogeniserade vätska, som antas vara en homogen suspension av bakterier, pipetteras aseptiskt till den steriliserade buljongen i provrör för buljongkultur. För odling på agarplattor pipetteras vätskesuspensionen på plattans yta och sprids aseptiskt.

För ytprover som tas för att studera mikrobiologin av fasta ytor (bordsskivor, kroppsytor eller sår) gnids ytan med en steriliserad tappning. Vattenpipan rörs på ytan av en steriliserad agarplatta. Från beröringspunkten görs strimmor av steriliserad slinga aseptiskt för att isolera bakterierna.

4. Inkubation:

De inokulerade buljongörerna och plattorna inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator.

5. Observation:

Turbiditet i flytande buljong och kolonier på agarplattor indikerar tillväxt av bakterier.

Material krävs:

Petriskålar (6 nos), 2 ml pipetter (5 nos), provrör (5 nos), koniska kolvar (100 ml, 250 ml och 500 ml-1 vardera), 250 ml bägare (2 nos), glas spridare, rostfritt stålpipettväska, hantverkspapper, tråd (eller gummiband), icke absorberande bomull, småpinnar, slinga, etylalkohol, natriumklorid (NaCl), 0, 1 N saltsyra (HCI), 0, 1 N natriumhydroxid ), destillerat vatten, näringsbuljong, näringsagar, vätskeprov (t ex vatten), fast prov (t.ex. jord), ytprov (t.ex. bordsskiva, kroppsytan, sår), pH-papper (eller pH-mätare), pistel och mortel (eller homogenisator), bunsenbrännare, varmluftsugn, autoklav, inkubator, laminärflödeskammare.

Procedur:

1. Fem pipetter (i ett rostfritt stålpipettväska), sex petriskålar och ett par stamper och mortel (eller en homogeniserande kopp) steriliseras vid 180 ° C i 3 timmar i en varmluftsugn. Alternativt kan de täckas med hantverkspapper, bundet med tråd eller gummiband och steriliseras i autoklav tillsammans med mediet (Figur 6.1).

2. 0, 85 g NaCl löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml bägare och 90 ml av denna saltlösning hälles i en 100 ml konisk kolv. Munnen är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

3. Ingredienserna av näringsmediumbuljongmedium som krävs för 100 ml buljongen vägs. Alternativt vägs föreskriven mängd färdigt näringsbuljongpulver (ingrediensblandning).

4. Ingredienserna (eller det färdiga pulveret) löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska genom att skaka och virvla. Dess pH bestäms med hjälp av ett pH-papper eller pH-mätare. PH justeras till 7, 0 med användning av 0, 1 N HCI om det är mer eller med användning av 0, 1 N NaOH om det är mindre. Kolven värms upp, om så krävs, för att lösa upp ingredienserna fullständigt.

5. Buljongen distribueras i 5 provrör (ca 10 ml vardera), deras munar bomullspluggade, täckta med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. Ingredienserna av näringsagaragar eller dess färdiga pulver som krävs för 200 ml av mediet vägs och löses i 200 ml destillerat vatten i en 500 ml konisk kolv genom skakning och virvling.

PH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 0 med 0, 1N HC1 om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt. Sedan är den bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

7. Svabbar är gjorda genom att vrida bomull runt spetsarna av små pinnar. Få sådana svabbar hålls i ett provrör med bomullstipsen nedåt. Provröret är bomullspluggat, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

8. Den 100 ml koniska kolven med 90 ml saltlösning, de 5 provrören med näringsbuljong, den 500 ml koniska flaskan innehållande 200 ml näringsagar-medium och provröret som innehåller svabbar steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) för 15 minuter i en autoklav.

9. Efter sterilisering avlägsnas de steriliserade materialen från autoklaven och får svalna under en tid utan att mediet solidiseras. Kylning av mediet förhindrar kondens och ackumulering av vattendroppar inuti plattorna. Om mediet redan har beretts och stelnat under lagring, måste det vara flytande genom att värma försiktigt tills det smälter fullständigt.

10. För att bereda näringsagaragar, innan det steriliserade näringsämnet agarmediet kyles och stelnar i varmt smält tillstånd, hälls det aseptiskt i de 6 steriliserade petriskålarna (ca 20 ml vardera) så att det smälta mediet täcker botten av petriskålarna helt.

Därefter täcks plattorna med sina lock och får svalna för att stelna mediet i dem. Vattendamp som kan kondensera på plattans och lockens inre yta avdunstas genom att hålla plattorna och locken i inverterad position i en inkubator vid 37 ° C under ca 1 timme.

11. Vätskeprovet (misstänkt att innehålla bakterier, t ex vatten) tas. En ml var och en av proverna pipetteras aseptiskt i 2 buljongrör (Figur 6.2). Rören är virvlade. Vätskeprovet pipetteras även aseptiskt på 2 agarplattor, 0, 1 ml vardera och spridas på ytan av agarmediet med användning av en flamsteriliserad glasspridare.

Innan varje spridning av glasspridaren dyker den i alkohol och flammas över en bunsenbrännare. De inokulerade buljongörerna och plattorna inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator. Plåtarna inkuberas i inverterad position upptill.

12. För det fasta provet (t.ex. jord) 10g av provet aseptiskt vägs och homogeniseras i den steriliserade stammen och mortel eller homogeniserskålen efter tillsats av 90 ml av den steriliserade koksaltlösningen från den 100 ml koniska kolven.

Denna homogena bakteriesuspension pipetteras aseptiskt i 2 buljongrör och 2 agarplattor som i steg 11 och inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar i inkubatorn (Figur 6.2). Plåtarna inkuberas i inverterad position upptill.

13. För ytprovtagning markeras den yta som misstänks innehålla bakterier (bordsskiva, kroppsytan, sår) för en enhetarea (t.ex. 1 cm ² ), som gnids av en steriliserad tappvatten. Vattnet är rört på ytan av de två utelämnade agarplattorna.

Streaking görs aseptiskt med en flamsteriliserad slinga. För strejk dras nästan parallella linjer av slingan från swab-touch-punkten. Dessa utgör de primära streckarna. Efter flamsterilisering av slingan dras sekundära streck nästan diagonalt till de primära streckarna. På liknande sätt framställs tertiära och kvaternära streck aseptiskt.

14. Därefter inkuberas plattorna i inverterad position, topp ned, vid 37 ° C i 24 timmar i inkubatorn (Figur 6.2).

15. En oinokulerad agarplatta och ett oinokulerat buljongrör inkuberas som kontroll för att säkerställa korrekt sterilisering som indikeras genom ingen tillväxt i dem. Detta steg är valfritt.