Bakterier närvarande i en prov med hjälp av seriell dilueringsagarpläteringsmetod eller Total Plate Count (TPC) Metod

Total plåträkning (TPC):

Att räkna upp bakterier som är närvarande i ett prov med hjälp av seriell utspädning agarpläteringsmetod eller total plåtantal (TPC) -metod.

Ändamål:

Omfattningen av bakteriell aktivitet i ett givet prov under en bestämd uppsättning villkor beror huvudsakligen på det totala antalet bakterier som finns närvarande i det, oberoende av deras art.

Därför är det mycket ofta nödvändigt att ta reda på det totala antalet bakterier som finns närvarande i prover av mat, vatten, jord, luft och vävnad under deras mikrobiologiska analys. Detta totala antal bakterier inkluderar både levande och döda bakterier. ' Döda bakterier kan inte växa och reproducera.

Det är bara levande bakterier (levande bakterier), som kan växa och föröka sig vilket resulterar i specifik bakteriell aktivitet. Därför krävs det mycket ofta för att räkna upp de livsdugliga bakteriecellerna i olika prover. De flesta uppräkningsmetoderna som direktmikroskopisk räkning, elektroniskt cellantal, kemiska metoder och spektrofotometrisk metod räknar emellertid både levande och döda celler.

Dessa metoder kan inte diskriminera mellan levande och döda celler. Därför är seriell utspädning-agarpläteringsmetod, som endast uppräknar de livskraftiga bakteriecellerna, den universellt använda metoden för att räkna levande livsdugliga celler i olika prover.

Princip:

En bestämd vikt av fast prov homogeniseras aseptiskt i nio volymer steril saltlösning för att få en homogen suspension av bakterier. Vätskeprovet används direkt som homogen suspension av bakterier. Suspensionerna av så erhållna bakterier späds seriellt (10 gånger, 100 gånger, 1000 gånger etc.). Här kallas 10-1, 10-2, 10-3 etc. utspädningar.

Deras reciprocals (10 1, 10 2, 10 3 etc.) kallas utspädningsfaktorer. En bestämd volym av suspensionen av bakterier från varje utspädning ympas på agarplattor och spridas ordentligt för att rymma de enskilda bakteriecellerna vid varandra och isolera dem från varandra.

Inokuleringen av bakterier för dess uppräkning görs i två tekniker enligt följande:

1. Häll platta teknik

2. Spridplåtsteknik

1. Häll plåtteknik:

I denna teknik tappas 1 ml av bakteriesuspensionen på en steriliserad petriskål och därefter hälls det flytande näringsmedelsagarmediet över det. Petriskålen svängs försiktigt, så att suspensionen blandas med mediet jämnt. Det får svalna och stelna.

2. Spridplatta Teknik:

I denna teknik tappas 0, 1 ml av bakteriesuspensionen på en framställd agarplatta. Därefter sprids suspensionens suspension jämnt på agarplattan med en steriliserad glasspridare.

För att minimera felet pläteras varje utspädd suspension på 2-5 replikatplattor. De inokulerade plattorna inkuberas vid 37 ° C under 24 timmar. Under denna period växer och multipliceras varje isolerad enskild bakteriecell på agarplattan och multiplicerar snabbt för att producera en makroskopisk synlig massa av bakterieceller som kallas en "koloni". Således representerar antalet kolonier på plattan antalet bakterier i provet.

Men under mycket spridning kan vissa celler ofta inte separeras ordentligt och få sådana oskiljda celler kan ge upphov till en enda koloni. Dessutom har få celler tendens att förbli i par, kedjor eller kluster.

Här producerar varje par, kedja eller kluster en koloni. Således representerar varje koloni i strikt mening inte en enda bakterie. Det är därför, istället för att uttrycka bakteriernas antal som "Nej. av bakterier / gm eller ml prov "uttrycks det ofta som antal kolonidannande enheter per g eller ml (CFU / g eller ml).

Den totala plattantalet (TPC) i det ursprungliga provet beräknas genom att multiplicera antalet CPU med respektive utspädningsfaktorer. "Reglerna för uppräkning" följs, medan man beräknar antalet bakterier i det ursprungliga provet.

Material som krävs:

Petriskål (15 nos), 2 ml pipetter (10 nos), 10 ml pipett (1 nr), provrör (10 nos), koniska kolvar (500 ml och 1 liter-1 nr vardera), 500 ml bägare (2 nos.), Glasskala, rostfritt stålpipettväska, hantverkpapper, tråd (eller gummiband), icke absorberande bomull, etylalkohol, natriumklorid (NaCl), 0, 1 N saltsyra (HCI) 0, 1N natriumhydroxid (NaOH), destillerat vatten, näringsagar, flytande prov (t.ex. dammvatten / avloppsvatten), fast prov (t.ex. jord / fiskkött / ostronkött / bearbetad mat), pH-papper (eller pH-mätare) och mortel (eller homogeniserare), bunsenbrännare, varmluftsugn, autoklav, inkubator, laminärflödeskammare, Quebec kolonisträknare.

Procedur:

1. Tio pipetter (i ett rostfritt stålpipettväska), 15 petriskålar och ett par pestle och mortel (eller en homogeniserande kopp) steriliseras i varmluftsugn vid 180 ° C i 3 timmar. Alternativt kan de täckas med hantverkspapper, bundet med tråd eller gummiband och steriliseras i autoklav tillsammans med mediet (Figur 6.6).

Antalet petriskålar och därmed mängden medel som skall användas beräknas beroende på antalet replikationer och utspädningar som erfordras. Här har glasvaran och mediet tagits för enkel replikation och utspädning upp till 10 -6 . Antalet glasvaror och mängden medium som tas för sterilisering är något mer för att undvika eventuella tillfälliga fel, eftersom sterilisering är en lång process.

2. 4, 25 g NaCl löses i 500 ml destillerat vatten för att få fysiologisk saltlösning (0, 85%). 225 ml av denna saltlösning hälles i en 500 ml konisk kolv. Munnen är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband. Det används som de första spädningsmedlen för att späda det fasta provet.

3. 9, 0 ml av den vänstra saltlösningen pipetteras också i var och en av de 10 provrören. Munnen är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband. Dessa används som utspädningsmedel för serieutspädning.

4. Ingredienserna av näringsagaragar eller dess färdiga pulver som krävs för 500 ml av mediet vägs och löses i 500 ml destillerat vatten i en 1-litig konisk kolv genom skakning och virvling.

PH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 0 med 0, 1N HC1 om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt. Sedan är den bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

5. Den 500 ml koniska kolven innehållande 225 ml saltlösning, de 10 provrören innehållande 9 ml saltlösning var och en 1 liter konisk kolv innehållande 500 ml näringsagar-medium steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

6. Efter sterilisering avlägsnas de steriliserade materialen från autoklaven och får svalna under en tid utan att mediet solidiseras. Kylning av mediet förhindrar kondens och ackumulering av vattendroppar inuti plattorna. Om mediet redan har beretts och stelnat under lagring, måste det vara flytande genom att värma försiktigt tills det smälter fullständigt.

7. För att framställa agarplattor, kyls och solidifieras det sterila näringsämnet agar i varmt smält tillstånd, aseptiskt i de 6 steriliserade petriskålarna (ca 20 ml vardera), så att det smälta medlet täcker bottnen av petri disken helt.

Därefter täcks plattorna med sina lock och får svalna för att stelna mediet i dem. Vattendamp som kan kondensera på plattans och lockens inre yta avdunstas genom att hålla plattorna och locken i inverterad position i en inkubator vid 37 ° C under ca 1 timme.

8. 25 g av det fasta provet (t.ex. fiskkött / ostronkött / bearbetad mat) är vikt och homogeniserad i 225 ml steriliserad saltlösning (utspädningsmedel) aseptiskt (Figur 6.7). Detta ger en 10 gånger utspädning (utspädning = 10 -1 ). För det flytande provet pipetteras 1 ml prov aseptiskt i ett 9 ml steriliserat saltlösningsrör. Detta ger också en 10 gånger utspädning (utspädning = 10 -1 ).

9. 1 ml av 10-1- spädningen överförs till 9 ml steriliserad saltlösning i ett annat provrör. Detta ger 100 gånger utspädning (utspädning = 10-2 ). Från 10 -2- spädningen droppas 1 ml i en steriliserad petriskål och 0, 1 ml på en agarplatta, från samma pipett. För varje utspädning används en separat steriliserad pipett. Efter användning doppas den i kassetten.

10. 1 ml av 10-2- spädningen överförs till 9 ml steriliserad saltlösning i ett annat provrör. Detta ger 1000 gånger utspädning (utspädning = 10 -3 ). Från 10 -3- spädningen droppas 1 ml i en steriliserad petriskål och 0, 1 ml på en agarplatta, från samma pipett. På liknande sätt fortsätter spädningen upp till 10 -6 seriellt, varje gång överföring av 1 ml till en steriliserad petriskål och 0, 1 ml till en agarplatta från samma pipett.

11. Därefter sprids suspensionens droppar på agarplattorna aseptiskt genom en steriliserad glasspridare. Efter spridning i varje platta är den flamsteriliserad genom doppning i alkohol och visar över en flamma. Detta är "spridteknik".

12. Petriskålarna innehållande 1 ml bakteriesuspension varje tas och steriliserat flytande näringsämne agar hälls in i dem. De svängs försiktigt, så att suspensionen blandas med mediet jämnt. Plattorna får svalna tills mediet stelnar. Detta är "pour plate technique".

13. Därefter inkuberas plattorna i inverterad position, topp ned, vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator (Figur 6.7).

14. En ej inokulerad agarplatta inkuberas som kontroll för att säkerställa korrekt sterilisering, såsom visas genom ingen tillväxt på den.

observationer:

Antalet bakteriekolonier på plåtarna räknas direkt eller med hjälp av en Quebec-koloniräknare. Från detta beräknas antalet bakterier närvarande per gram eller ml av det ursprungliga provet. Detta kallas uppräkning.

Regler för uppräkning:

1. Petriskålar med 30 till 300 kolonier bör övervägas.

2. Genomsnittligt antal duplikat och triplikat (R 1, R 2 R 3 ...) anses endast om en räkning inte är mer än dubbel av den andra. Om en är mer än dubbel av det andra lägre värdet tas.

3. För hällplattsteknik är bakterieantalet nrX 10 c / gm, där c = utspädningsfaktor. För spridplattsteknik är bakterieantalet nr X10 c + 1 / g, där c = utspädningsfaktor. Numret konverteras till två decimaler i form av (x.yz X 10 m ). Exempelvis uttrycks 288 X 10 4 som 2, 88 X 10 6 .

4. Om kolonnantalet i alla utspädningar är mer än 300, räknat för högsta utspädning och om det i alla utspädningar är mindre än 30, räknar man med att den lägsta spädningen beaktas. I båda fallen representeras räknat som: Beräknat nr. X 10 c / g eller ml för hällplattsteknik och beräknad nr. X 10 c + 1 / g eller ml för spridplattsteknik.

5. Om ingen koloni observeras vid eventuell utspädning, är den representerad som: Beräknad <1 x lägsta utspädning.

6. Eftersom serieutspädningen äger rum i termer av 10 gånger, är det uppenbart att inga två utspädningar kan ha kolonier mellan 30 och 300. Om exempelvis 10 -3 har 50 kolonier, bör 10 -2 ha 500 (dvs> 300) och 10 -4 bör ha 5 (dvs <30) kolonier.

Detta sker emellertid inte i verkligheten, eftersom bakterier inte uppträder som en homogen lösning; förekommer snarare som en suspension i utspädningsmedlen. Om det finns två utspädningar som har räknbara kolonier (mellan 30 och 300) beräknar man först antalet kolonidannande enheter / gm eller ml med varje utspädning.

Om ett värde är mer än det dubbla av det andra, rapportera det lägre värdet. Om inte, ta medlet av de två värdena och rapportera det värdet.