Syfte att isolera olika bakterier som finns i en given prov och upprätthålla deras rena kulturer

Syfte att isolera olika bakterier närvarande i ett givet prov och behålla sina rena kulturer.

Ändamål:

Bakterier som finns i naturen, förekommer inte som segregerade arter, utan de uppträder som blandade populationer av olika arter.

För att studera de enskilda bakteriearterna måste man först skilja sig från blandade populationer. Denna process kallas "isolering av bakterier".

Det åstadkommes genom att växa den blandade populationen av bakterier på ytan av ett fast medium till diskreta kolonier. "Kolonier" är individuella, makroskopiskt synliga massor av bakterier odlade på ytan av fast medium, som var och en representerar multiplikationen av en enda bakterie.

Eftersom varje koloni kommer från tillväxten och upprepad multiplikation av en enda bakterie, hör alla bakterier närvarande i kolonin till samma art. Således representerar varje koloni en mycket stor population av en enda bakterieart.

Dessa kolonier överförs aseptiskt för att separera näringsagaragar och får växa där. De isolerade bakterierna, som odlas separat på agarskenor kallas "rena kulturer". Varje 15 till 30 dagar överförs de till färska snoddar, så att de inte förlorar sina ursprungliga egenskaper på grund av överkrympning, brist på näringsämnen och ackumulering av metaboliter.

På detta sätt upprätthålls rena kulturer av bakterier i laboratoriet genom upprepad överföring till fräscha skenor med jämna mellanrum. Denna process kallas "underhåll av ren kultur". Rena kulturer upprätthålls i laboratoriet för deras efterföljande identifiering genom olika färgning, biokemiska, serologiska och molekylära tekniker såväl som för deras framtida användning.

"Kulturer" är vanliga rena kulturer, vars identitet har upprättats internationellt till släkt, art, underart, typ eller deltypsnivå. De upprätthålls i internationellt erkända mikrobiologilaboratorier.

Andra laboratorier kan få dem från dessa laboratorier och upprätthålla i sina egna laboratorier som deras stamkulturer, genom upprepad överföring till färska snedningar med jämna mellanrum. De används för bekräftad identifiering av rena kulturer erhållna i dessa laboratorier genom jämförelse av deras egenskaper med de hos stamkulturerna.

Princip:

Den blandade populationen av bakterier som finns närvarande i ett givet material (fast, flytande eller yta) odlas på näringsagarplattor genom spridplatta eller strimladplåtmetod som beskrivits tidigare under "Odling av bakterier". Varje isolerad koloni som finns på en agarplatta består av en bakterieart, eftersom varje koloni växer från en enda bakterie.

Således isoleras bakterier på agarplattor med två tekniker enligt följande:

(a) Spridplåtsteknik

(b) Streckplattsteknik

Representativa kolonier (kolonier med olika egenskaper) väljs och aseptiskt inokuleras för att separera agarskenor för att få de rena kulturerna. Efter varje 15 till 30 dagar överförs de till färska snedställningar för underhåll av dessa rena kulturer.

Material som krävs:

Teströr (5 nos), 250 ml konisk kolv (1 nej), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCl, destillerat vatten, näringsagar, icke absorberande bomull, slinga, hantverkspapper, tråd (eller gummiband), pH-papper (eller pH-mätare), bunsenbrännare, autoklav, laminärflödeskammare, inkubator, plattor innehållande isolerade kolonier av bakterier (spridplatta eller streckplatta).

Procedur:

1. Beståndsdelarna i näringsagaragar eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska genom att skaka och virvla (Figur 6.4).

2. pH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 0 med 0, 1 N HC1 om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre.

3. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt.

4. Innan det stelnar, fördelas mediet i varmt smält tillstånd i 5 provrör (ca 20 ml vardera).

5. Provrören är bomullspluggade, täckta med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. De steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

7. Efter sterilisering avlägsnas de från autoklaven och hålles i ett lutande läge för att kyla och stelna mediet. Dessa provrör innehållande stelnat näringsmedel-agarmedium i lutande tillstånd kallas "nutrient agar slants".

8. Steg 10 och 11 bör utföras efter aseptisk teknik, företrädesvis i en laminär strömningskammare. Munnen av behållarna innehållande steriliserade medier eller kulturer ska visas över flammen av bunsenbrännaren efter att ha tagit bort bomullspluggen och innan den sätts tillbaka.

Loops, före användning måste steriliseras över flammen genom att värma till rött hett och sedan kyla i 30 sekunder för att svalna till rumstemperatur. De ska aldrig användas när det är mycket varmt, eftersom de dödar mikroberna när de berörs.

9. I föregående experiment, om isolerade kolonier kunde observeras på spridplattan eller streckplattan, väljs fem kolonier med olika egenskaper som representativa kolonier.

10. En slinga steriliseras över flamma och en slinga av bakterier från var och en av de representativa kolonierna tas aseptiskt. Slingan introduceras i agarskenan, så att slingan av bakterier går till änden av skenan. Slingan flyttas utåt på ett vågigt sätt som rör ytan på snedstället, så att en vågig linje bildas.

11. Slingan är flamsteriliserad och på liknande sätt ympas resten av de fyra representativa kolonierna separat till vänster över fyra snedställningar. Slingan steriliseras efter varje ympning.

12. De fem inokulerade skenorna inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator.

Observationer (kulturella egenskaper):

(i) En vågig linje med tillväxt längs dess längd observeras:

Tillväxt har skett.

Lutningen observeras för snedställande egenskaper enligt följande (Figur 6.5).

1. Ökning av tillväxt:

Mängden tillväxt är betecknad som ingen, liten, måttlig eller stor.

2. Pigmentering:

Kromogena mikroorganismer kan producera intracellulära pigment som är ansvariga för färgningen av organismen som ses i ytkolonier. Andra organismer producerar extracellulära lösliga pigment som utsöndras i mediet och producerar också en färg. De flesta organismer är emellertid icke-kromomera och kommer att bli vita till gråa.

3. Optiska egenskaper:

Optiska egenskaper kan utvärderas på grundval av mängden ljus som överförs genom tillväxten.

Dessa egenskaper beskrivs som:

(en) Opak: Ingen ljusöverföring.

(B) Genomskinlig: Delvis ljusöverföring.

4. Form:

Utseendet på tillväxtlinjen för ensträngning på agarytan betecknas som följer:

(en) Filiform: Kontinuerlig, trådlik tillväxt med glatta kanter.

(B) Echinulate: Kontinuerlig, trådlik tillväxt med oregelbundna kanter.

(D) Effuse: Tunn, spridande tillväxt.

(E) Arborescent: Trädliknande tillväxt.

(f) Rhizoid: Rotliknande tillväxt.

(ii) Ingen tillväxt längs inokulationslinjen:

Felaktig inokulationsmetod, Inokulering upprepas. C Uppräkning av bakterier.

C. Uppräkning av bakterier:

Omfattningen av bakteriell aktivitet i ett givet prov under en bestämd uppsättning villkor beror huvudsakligen på det totala antalet bakterier som finns närvarande i det, oberoende av deras art. Därför är det mycket ofta nödvändigt att ta reda på det totala antalet bakterier som finns närvarande i prover av mat, vatten, jord, luft och vävnad under deras mikrobiologiska analys.

Beräkning av antalet bakterier i ett givet prov kallas "uppräkning av bakterier". Det finns olika metoder för uppräkning av bakterier enligt nedan. Alla dessa metoder behöver bakterier vara närvarande i en homogen suspension.

Därför antas flytande prover vara homogena suspensioner av bakterier och används direkt, medan fasta prover homogeniseras i sterila saltlösningar för att få homogena suspensioner av bakterier.

Används inte vanligtvis:

(I) Direkta metoder:

(a) Direktmikroskopisk räkning

(b) Elektronisk cellräknare

(II) Indirekta metoder:

(D) Turbidimetrisk metod

(E) Membranfilterantalet

Mest använda:

(f) Seriell utspädning-agarpläteringsmetod eller Total Plate Count Method (TPC-metod)

(a) Direktmikroskopisk räkning:

I denna metod räknas antalet bakterier närvarande i en alikvot av den homogena suspensionen av bakterier direkt under ett mikroskop och det totala antalet bakterier i provet bestäms matematiskt.

Fördelen med denna metod är att den är mycket snabb. Nackdelarna är att både levande (levande) och döda celler räknas och metoden är inte känslig för populationer med färre än en miljon bakterier per milliliter.

Räkning kan göras i två metoder enligt följande:

(i) Petroff-Hauser-kammaren:

Det är en specialiserad räknekammare, där en alikvot av den homogena suspensionen av bakterier sätts för att räkna direkt under ett mikroskop.

(ii) Ras Smear:

Bakterieceller räknas direkt under mikroskop med färgade smutsar som är begränsade till ett område av 1 mm ² på glidbanan. Det används främst för uppräkning av bakterier i mjölk.

(b) Elektronisk cellräknare:

En elektronisk cellräknare som "Coulter counter" används för att direkt räkna antalet bakterieceller. En homogen suspension av bakterieceller framställda i en ledande vätska får passera genom en minutöppning, över vilken en elektrisk ström flyter.

Motståndet vid öppningen registreras elektroniskt. När en cell passerar genom öppningen, som icke-ledare, ökar motståndet tillfälligt. Antalet gånger motståndet ökar tillfälligt registreras elektroniskt vilket indikerar antalet bakterier närvarande i suspensionen.

Fördelen med denna metod är att den är extremt snabb. Nackdelarna är att både levande (livskraftiga) och döda celler räknas och instrumentet kan inte särskilja mellan bakterieceller och inert partikelformigt material.

(c) Kemiska metoder:

Dessa metoder uppskattar kvantiteten av dessa ämnen, främst kemikalier, vilket ökar med ökningen av bakteriepopulationen.

De huvudsakliga parametrarna beräknas enligt följande:

(i) Proteinkoncentration

(ii) DNA-koncentration

(iii) torrvikt

(iv) Koldioxidproduktion

(v) Syreupptagning

(vi) Produktion av mjölksyra

(d) Turbidimetrisk metod:

När bakterier odlas i flytande näringsrika medier (t.ex. näringsbuljong), gör deras kraftiga tillväxt medierna grumliga, eftersom bakteriecellerna oftast förblir suspenderade i dem. Grumligheten ökar med ökningen av antalet celler i media. När grumligheten ökar ökar mediet "absorption" eller "optisk densitet (OD)" i media.

OD av suspensionen av bakterieceller i media mäts med användning av en spektrofotometer vid 600 nm. Antalet bakterieceller i suspensionen är utmärkta genom att jämföra OD med en standardkurva framställd genom att plotta OD-värdena för olika kända koncentrationer av bakterier. Metoden är snabb, men begränsad till bakteriella suspensioner av mer än 10 miljoner celler.

(e) Membranfilterantal:

Denna metod används när antalet bakterier i ett flytande prov är mycket mindre. För att öka koncentrationen av bakterier filtreras först det flytande provet aseptiskt genom en steriliserad membranfilterapparat med användning av ett sterilt membranfilter.

Membranfiltret innehållande de infångade bakterierna överförs aseptiskt till en steril petriskål innehållande en absorberande dyna mättad med ett selektivt differentialvätskemedium. Mediet suger ut på filterets yta. Efter inkubation räknas antalet kolonier som bildas på filtret med ett enkelt mikroskop.